来自酵母的U R A３基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体D N A进 行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导入 酵母细胞，可整合至酵母染色体上，成为染色体D N A的一个片段。
（２）真核生物病毒载体
·
①哺乳动物病毒载体：这类病毒载体具有许多突出优点。例如，动物病
毒能够有效识别
宿主细胞，某些动物病毒载体能高效整合到宿主基因组中以及高拷贝和强启动子等，有利于 真核外源基因的克隆与表达。许多哺乳动物病毒如SV４０ 、腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒 等改造后的衍生物可作为基因载体。
②昆虫病毒载体：昆虫杆状病毒的衍生物作为载体具有的优点，主要为高克隆容量，
克
隆外源D N A片段大小可高达１００kb；其次具有高表达效率，外源DN A的表达量达到细胞 蛋白质总量的２５ ％左右，甚至更多；此外，它具有安全性，仅感染无脊椎动物，并不引起 人和哺乳动物疾病。
③植物病毒载体：一些R N A病毒和D N A病毒已被改造为植物基因工程载体。目前，
植物基因工程操作较多使用双链DN A病毒载体，如花椰菜花叶病毒载体。
第三节 基因工程的基本技术程序
一个完整的、
用于生产目的基因的基因工程技术程序包括的基
本内容有：
① 外源目的基因的分离、克隆以及目的基因的结构与功能研究，这一部分的工作是整个基因工程
的上游部适合转移、表达载体的构建或目的基因的表达调控结构重组； ② 外源基因的导入；
3 外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选； 4． 外源基因表达产物的生理功能的核实； ③
⑥转基因新品系的选育和建立以及转基因新品系的效益分析； ⑦生态进化安全保障机制的建立； ⑧消费安全评价。 一、提取目的基因１ ．
基因文库与cDN A文库的构建
利用重组D N A技术，可将某一原核微生物或真核微生物染色体基因组的全部遗传信息 贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库（genomic library）或cDN A文 库（cD N A library）之中，犹如将文献资料贮存于图书库一样，以供长期贮存和随时调取克 隆基因使用。
（１）基因文库的构建
所谓基因文库是指生物染色体基因组各D N A片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只 含基因组中某一特定的D N A片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗 传信息，即全部D N A序列。
基因文库构建的简单步骤： ①从组织或细胞提取基因组D N A； ②用限制性
酶部分水解
或机械剪切成适当长度的D N A片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的D N A片段； ③ 通常采用λ噬菌体或柯斯质粒载体等容载量较大的克隆载体，在适当位点将载体切开； ④将 基因组D N A片段与载体进行体外连接； ⑤重组体DN A直接转化细菌或用体外包装的重组
λ噬菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组D N A的细菌群体或噬菌体群体，即构 成基因文库。
（２）cD N A文库的构建
所谓cDN A文库是指生物体全部mRN A的cD N A克隆总体。cD N A文库中的每一个克 隆只含一种mR N A信息。
由于真核生物基因组十分庞大，因而要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到 某一目的基因。但由于细胞中mR N A分 子数 要 比 基因 组 的基 因 数小 得 多（通 常大 约 仅 有 １５ ％左右基因被表达） ，因而若由mR N A逆转录为cD N A，那么所构建的cD N A文库的库容 量相应较基因文库小。
构建cDN A文库的主要步骤：
② 从生物体或细胞中提取mR N A；
②利用逆转录酶以寡聚（dT）或随机寡聚核苷酸为引物合成cD N A一条链；
③利用DN A聚合酶I，以cDN A第一条链作为模板，用适当引物合成cDN A第二条链，常用R N A酶H在杂交分子的mR N A链上造成切口和缺口，产生一系列R N A引物，或是除去杂交分子的mR N A后，加入随机引物，即可合成第二条链； ③ cD N A与载体的体外连接；
⑤噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于cD N A不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。二、目的基因与运载体结合 三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测和表达
第四节 转基因动物和植物
一、向动物体内转入外源基因（１）显微注射法： （２）动物病毒载体法： （３）电转移法： （４）胚胎干细胞法： （５）精子载体法： （６）定位整合技术：
第五章 酶工程
酶工程是现代生物技术的重要组成部分，其特点是利用酶、含酶细胞器或细 胞（微 生 物、植物、动物）作为
生物催化剂来完成某些重要的化学反应。应用范围包括医药、食品、
化学工业、诊断分析和生物传感器等。涉及的品种很多，诸如糖化酶、淀粉酶、洗涤剂用酶 以及与β唱内酰胺抗生素生产有关的青霉素酰化酶、 ７唱A CA酰化酶等，其市场需求、生产规 模和产值均很可观，并已产生巨大的经济效益。
酶是一种生物催化剂，它具有作用专一性强、催化效率高等特点，能在常温常压和低浓 度条件下进行复杂的生化反应。
第一节 酶工程概述
一、酶工程简介
①酶的产生； ②
酶的分离纯化； ③酶的固定化； ④生物反应器。固定化酶比自由酶具有更多的优点： ①稳定性高； ②酶可反复使用； ③产
酶工程主要指自然酶制剂在工业上的大规模应用，有４个部分组成：
物纯度高，副产物少，有利于提纯； ④生产可连续化、自动化； ⑤设备小型化，节约能源等。
四、酶的分类、组成和结构特点（一）酶的分类
１９６１年，国际生化联合会酶学委员会提出将酶分为６类。 （有各
种脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等。
１）氧化还原酶：在生物体内参与产能、解毒和某些生理活性物质的合成。重要的
（２）转移酶：在体内外将某基团从一个化合物转移到另一个化合物，参与核酸、蛋 白
质、糖及脂肪的代谢和合成。重要的是一碳基转移酶、酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基 转移酶等。
（３）水解酶：在体内外起降解作用，也是人类应用最广的酶类。重要的是脂肪酶、糖
苷
酶、肽酶等。水解酶一般不需要辅酶。
（４）裂合酶：这类酶可脱去底物上某一基团而留下双键，或者可相反地在双键处加入
某
一基团。它们分别催化C－C、C－O、C－N、C－S、C－X（F，CI，Br，I）和P－O键。
（５）异构酶：此类酶为生物代谢需要而对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、
差向异构、顺反异构、醛酮异构、分子内转移、分子内裂解等。
磷酸酯作为结合能源，有的还需要金属离子辅助因子，分别形成C－O键、C－S键、C－C 键和磷酸酯键。
６ ．连接酶（合成酶） ：这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要A T P作为高能
第三节 酶的分离纯化
由于酶很不稳定，在提取时容易变性失活，因而
提取时应注意：
（１）温度：整个提纯操作应尽可能在低温下（０ ～ ４ ℃ ）进行，以防止酶的变性失活或蛋 白质水解酶对目的酶的水解（尤其是在有机溶剂或无机盐存在下更应注意） 。
（２）pH：在提纯过程中一般采用缓 冲液作为溶剂，防止过酸或过碱。对一特定的酶， 溶剂p H的选择应考虑酶的pH稳定性以及酶的溶解度。
（３）盐浓度：因为大多数蛋白质具有盐溶性质，所以在抽提过程中可选用合适浓度的盐 溶液以促进蛋白质溶解；但要注意当盐浓度过高时，酶容易变性。
（４）搅拌：剧烈搅拌容易引起蛋白质变性，提纯中应避免剧烈搅拌和产生泡沫。 （５）微生物污染：酶液是微生物生长的良好培养基，在提纯过程中应尽可能防止微生物
一、酶制剂的制备
酶的制备流程一般包括破碎细胞、溶剂抽提、离心、过滤、浓缩、干燥这几个步骤，对
某些纯度要求很高的酶则需经几种方法乃至多次反复处理。
（１）破碎细胞：除了胞外酶的提取以外，所有胞内酶需将细胞破碎后方可进一步抽提。
破碎细胞有许多方法，动植物细胞常用高速组织捣碎机和组织匀浆器破碎，而微生物细胞的 破碎则有机械破碎法、酶法、化学试剂法和物理破碎法等多种。
（２）溶剂抽提：
（３）离心分离：离心分离是酶分离提纯中最常用的方法，主要用于除去细胞碎片或抽提 过程中生成的沉淀物。工业上常用板框压滤机来完成酶的粗分离。
（４）浓缩：由于发酵液或酶抽提液中酶的浓度一般都比较低，必须经过进一步纯化以便 于保存、运输和应用。事实上，大多数纯化酶的操作如吸附、沉淀、凝胶过滤等均包含了酶 的浓缩作用。工业上常采用真空薄膜浓缩法以保证酶在浓缩过程中基本不失活。
（５）干燥：酶溶液或含水量高的酶制剂即使在低温下也极不稳定，只能作短期保存。为 便于酶制剂的长时间的运输、储存，防止酶变性，往往需对酶进行干燥，制成含水量较低的 制品。常用的干燥方法有真空干燥、喷雾干燥等。
二、酶的纯化与精制
１ ．根据酶分子大小和形状的分离方法
（１）离心分离： （２）凝胶过滤： （３）透析与超滤：
２ ．根据酶分子电荷性质的分离方法 （
１）离子交换层析： （２）层析聚焦： （３）电泳： （４）等电聚焦：
第五节 酶反应器
以酶为催化剂进行反应所需要的设备称为酶反应器。酶反应器有两种类型：一类是直接 应用游离酶进行反应的均相酶反应器；另一类是应用固定化酶进行反应的非均相酶反应器。 均相酶反应可在批式反应器或超滤膜反应器中进行，而非均相酶反应则可在多种反应器中进 行。酶反应器的种类很多，大致可根据催化剂的形状来选用。粒状催化剂可采用搅拌罐、固 定化床和鼓泡塔式反应器，而细小颗粒的催化剂则宜选用流化床。对于膜状催化剂，则可考 虑采用螺旋式、转盘式、平板式、空心管式膜反应器。事实上，选用某种固定化酶最合适的 反应器型式，并无明确的准则，必须综合考虑各种因素。
选择反应器型式时应考虑的因素： （１）催化剂的形状和大小。 （２）催化剂的机械强度和比重。
（３）反应操作的要求（如pH是否可控制） 。 （４）对付杂菌污染的措施。 （５）反应动力学方程类型。 （６）底物（溶液）的性质。
（７）催化剂的再生、更换的难易。
（８）反应器内液体的塔存量与催化剂表面积之比。 （９）传质特性。
（１０）反应器制造成本和运行成本。 一、酶反应器的基本类型
１ ．搅拌罐型反应器
２ ．固定床型反应器固定化床反应器操作方式主要有两种：一是底物溶液从底部进入而由顶部排出的上升流动方式；另一种则是上进下出的下降流动方式。３ ．流化床型反应器 ４ ．膜式反应器