病因子的抑制因子，内源性抗病机制能促进抗病物质的合成和分泌，抑制致病因子的合成和分泌。阐明防治心脑血管疾病的自身抗病机制，调节、恢复和补充体内的内源性抗病物质，修复心血管细胞的损伤和功能，是防治心血管疾病的一个重要的新方向，亦是发展心血管新药物和防治新途径的重要源泉。 1．寻找参与缺氧预处理引起的细胞保护作用的内源性物质 ①通过新建立的蛋白质组学技术，在肺II型上皮细胞找到经缺氧预适应明显表达上调的蛋白之一钙网蛋白(Calreticulin, CRT)，钙网蛋白介导了该细胞的缺氧/预适应对细胞缺氧再复氧（再灌注）损伤, 其机制是通过增加抗氧化的硫氧还蛋白（thioredoxine）抑制氧自由基的产生，最终抑制JNK MAPK-AP-1而实现的。 ②采用蛋白质组技术鉴定出心肌缺血预适应延迟相的13个差异蛋白，其中谷胱甘肽巯基转移酶Yb4、蛋白酪氨酸磷酸酶εC、长链脂肪酸辅酶A连接酶、维生素D结合蛋白和重组活化蛋白2等8个蛋白质属首次发现与心肌缺血预适应有关。这些差异蛋白可能通过其分子伴侣功能、清除自由基、改善心肌能量代谢等参与了心肌缺血预适应延迟相的心肌保护作用。 ③从多个水平探讨了氧化应激损伤时心肌细胞凋亡的发生机制。证实了HSP70可通过抑制线粒体通路和死亡受体通路的活化及其cross-talk通路，从而减轻H2O2所致的原代培养大鼠心肌细胞和C2C12肌原细胞的凋亡。采用免疫共沉淀技术发现了多个与HSP70 及αB晶状体蛋白相互作用的凋亡相关蛋白。(Free Rad Biol Med, 2005, 39:658-667) ④采用过表达热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)基因的细胞株及HSF1 基因敲除小鼠，发现HSF1可促进另一核转录因子KLF4 的表达，而KLF4可促进αB晶状体蛋白，HSP25，HSP84和 HSP86等热休克蛋白的表达。上述发现揭示了HSP基因表达调控的新机制。 2．炎症/缺氧诱导具有细胞保护作用的CGRP从神经和免疫细胞分泌及其意义的研究 ①除了我们发现致炎因子IL－1?和趋化因子可以刺激感觉神经元神经肽降钙素基因相关肽CGRP表达和释放增多（J Neurosci Res，2003, 73:188-197; J Neurosci Res 2005; 2005, 82:51-62）以外，我们新发现了激活人和大鼠T淋 26
巴细胞一定时间后还可诱导免疫细胞神经肽降钙素基因相关肽CGRP表达和分泌增多，后者以自分泌和旁分泌形式抑制T淋巴细胞的增殖和IL-2的分泌（J Neuroimmunol, 2002, 130: 155-162），致炎因子IL－1?还可以诱导非特异免疫细胞：II型肺上皮细胞分泌神经肽降钙素基因相关肽CGRP增多，其机制是通过PKC?-p38 MAPK-核转录因子NF-?B从而引起?-CGRP分泌增加（FASEB J, 2004;18:1603-1605）。分泌的CGRP通过作用于CGRP 1受体抑制II型肺上皮细胞IL－1?引起的趋化因子MCP-1 和IL-8的分泌及其分子机制（Submitted, 2005）；CGRP还可通过作用于T细胞的CGRP 1受体抑制Th1和增加Th2功能，从而减轻1型糖尿病大鼠胰岛?细胞炎症损伤(Eur J Immunol, 2003, 33:233-242)。由此提出这可能是免疫系统保持内环境稳态的调节机制之一，CGRP作为介导神经系统和免疫系统的调制分子发挥着重要作用。 ②从离体肺II型上皮细胞水平证明，外源CGRP或CGRP转基因法以及外源性CGRP拮抗剂或肺II型上皮细胞CGRP缺失（RNAi）法均证明，CGRP参与缺氧预适应的机制之一是通过PKC?的增加，进而增加HSP70的表达，介导了肺II型上皮细胞缺氧/预适应对细胞缺氧再灌注损伤(J Biol Chem, 2005, 280:20325-20330)。此外，经过外源CGRP或CGRP转基因法以及外源性CGRP拮抗剂或CGRP缺失（RNAi）法以及整体动物CGRP基因治疗法证明CGRP通过增加平滑肌细胞凋亡而抑制血管损伤后的再狭窄发生（Am J. Physiol Heart Circ Physiol, 2004, 287: H1582-H1589）。 3．生长素（Ghrelin）的心血管保护作用 Ghrelin是含28个氨基酸残基的多肽，是2000年新发现的、生长激素促分泌素受体的内源性配体，调节机体代谢称为“终极代谢激素” 。近来发现心血管组织能生成ghrelin而且富含ghrelin受体。我们较系统研究了ghrelin的心血管病理生理意义，观察到ghrelin可以部分纠正败血症休克大鼠的血流动力学紊乱和代谢障碍；ghrelin具有增强心功能、减轻缺血再灌注引起的心肌损伤及改善心肌氧耗的作用；具有治疗异丙基肾上腺素引起的心肌损伤和拮抗血管钙化等治疗效应。体外实验。ghrelin抑制人内皮细胞与单核细胞的结合、抑制NF-kB的激活和体内内毒素引起的促炎因子的产生。Ghrelin的抗炎作用提示它在动脉粥样硬化尤其是伴发肥胖病人（肥胖病人的ghrelin是降低的）发病中可能起重 27
要的调节作用。我们提出了Ghrelin是内源性心血管细胞保护物质的观点，受到国际学术界关注，发表的文章已被引用40余次。 上述研究结果发表在 Circulation,2004,109: 2221-2226 Acta Pharmacol Sin,2003, 24:45-49. Eur J Pharmacol, 2003,473: 171-176 Acta Pharmacol Sin. 2004,25:1131-1137 Regulatory Peptides，2004,122：173-178； Regulatory Peptides,2005,129:167-176 （五）心血管活性物质和信号转导通路的复杂体系研究 1．代谢同源性分子‘家系’网络调节的研究模式 小分子活性物质种类繁多，其生物学效应间的相互作用形成复杂网络调控。目前对于分子间的相互作用的研究，主要按‘功能同源’（舒缩血管、细胞生长分化等功能）或‘结构同源’的分子群研究。这种研究模式对小分子活性物质并不很合适，因其结构简单（‘结构同源’少）而且功能广泛（‘功能同源’难归类）。 我们通过对肾上腺髓质素（Adrenomedullin）的系统研究，注意到活性多肽的“分子内调控”现象，即大分子的多肽原前体（prepro-peptides）在体内形成的众多活性小分子肽段和酶解小分子中产物；活性多肽在体内的功能及对疾病的最终影响取决于这些分子相互作用的综合效应。我们对作为生物活性分子的蛋氨酸的代谢研究，蛋氨酸代谢产物包括S-腺苷蛋氨酸、，半胱氨酸、S-腺苷同型半胱氨酸、同型半胱氨酸、胱氨酸、牛磺酸、H2S等，各自具有很强的生物学活性，但在体内的功能及对疾病的最终影响取决于这些分子相互作用的综合效应。我们提出小分子活性物质的 “代谢同源家系”研究的新模式，研究这些同代谢来源的分子群的相互作用网络，作为研究机体复杂网络调控体系的一部分（初级部分）。在一定程度上以整合的观点阐明疾病的发生机制，而且可能从同一‘家系’分子间的相互作用关系提示复杂疾病防治的新策略。 2、肾上腺素受体在心血管重塑调控中的网络调节模式研究 现代医学在还原论指导下对生命和疾病的认识还是局部的、分离的和不完善的；我们还缺乏对生命系统和生物学行为综合的、整体的和本质的认识和理解，这就需要引入新的思维模式来研究生命现象。心脑血管疾病是多因素参与发病的复杂疾病。我们探索用复杂系统的研究理念和方法研究肾上腺素受体对心脏血管重塑的调控网络。我们先从激动肾上腺素受体引起心血管重塑时的基
28
因表达调控网络入手，初步确定了在现有基因芯片上的心脏和血管平滑肌表达的基因，找到一些与重塑过程相关的基因（组）群，发现了不同肾上腺素受体（及亚型）激动引起不同的基因表达谱变化，揭示了生理性心脏生长和病理性心脏肥厚过程中基因表达谱的差别。在正常生长发育中的生理性心肌重塑，基因表达群谱的改变利于维持生长发育所需要的平衡状态。病理性心肌重塑所涉及的基因表达群谱改变与生理性重塑虽有相似之处，但病理因素的存在引起了特征性变化，为细胞结构物质基因群和能量代谢基因群的不平衡变化，这种变化有可能是最终导致心衰的病理基础。在各种不同因素引起的心血管重塑过程中存在有一些共同变化基因，对这些基因的认识有助于揭示重塑过程的共同调节环节和关键信号分子。 这种研究路径和手段不同于传统方法，它需要庞大的原始数据系统、优秀的数据分析系统和新的分析思想。我们与北大数学系教授合作，利用已获得的数据，反复模拟和修正，初步建立了适合本课题需要的数据聚类和网络分析的一些计算方法和软件，确定了一些基因类群以及一些基因与基因之间的依存和调控关系，尝试了对数据的挖掘，构建局部的基因表达网络和建立了初级数学模式。通过对基因群的启动子预测分析，发现聚为同一类的基因可能有共同的启动子，为揭示基因调控规律提供了依据。在此基础上，我们进一部和中科院生物物理所合作，构建转录因子及受其调控的基因之间的关系，作为支持向量机方法的学习集，通过bayes估计和启动子分析，结合传统分子生物学试验构建信号转导通路调控网络。我们对肾上腺素受体引起心肌重塑的比较蛋白质组学进行了研究。与基因表达变化相似，肾上腺素受体激动引起心肌细胞蛋白质表达变化主要是细胞结构蛋白、骨架蛋白、转运相关膜蛋白、信号转导相关蛋白及转录因子等，深入的数据分析和信息挖掘正在进行中。这部分工作将在蛋白质水平揭示信号分子的调节网络，为本项目的深入和持续发展奠定了基础。此外，我们建立了大鼠心肌细胞二维凝胶电泳参考图谱和数据库，并公布于我们的网上，以便资源共享。这些工作部分发表于：Cell Mol Life Sci,2003,60:2200-2209；Clin Exp Pharmacol Phy,2003,30:827-832; Clin Exp Pharmacol Physiol, 2004,31:602-607）等杂志上。 为了推动国内复杂系统科学与生命科学、信息科学和认知科学间的结合以促 29
进生命科学研究的突破，2005年5月我们项目组在韩启德院士和北京大学力学与工程科学系的黄琳院士联合建议和主持下，举行了以?生物、医学中的复杂性问题研讨会?为主题的香山科学会议。会议深入探讨了生物、医学中具体的重大复杂系统科学问题，并探讨了发展生物医学复杂系统研究的策略，对推进我国健康科学基础研究的发展具有重要意义。 （六）心血管细胞内分子转运体系的研究 目前心脑血管的防治方法和药物，主要在于细胞外，如生长因子、细胞因子、活性多肽、受体激动剂和阻断剂等。这些外源性干预的防治方法取得了很好的疗效，但忽略了内源性治疗—身体内源性防御体系。现在疾病的治疗正从细胞外转向细胞内，通过调节细胞内多种信息传递体系和转录表达途径来控制细胞的生长、发育和表型的变化，逆转心血管再塑来防治心脑血管病。本项目探寻和构建 细胞内给药载体，发现了新的具有穿膜和穿核效应的分子PDCD5，以及PDCD5的转导功能区，利用PDCD5的转导功能区成功将P53多肽和NEMO结合多肽导入细胞，并发挥了多肽的生物学活性。在电脉冲导入技术的条件优化方面开展了一系列的研究，建立的新的技术路线，并在开展了多种治疗性基因的小鼠骨骼肌电脉冲导入治疗糖尿病、肥胖、骨质疏松等疾病的整体动物实验研究。这些工作可能具有前瞻性的临床应用价值。原计划书对壳多糖导入技术和肽核酸导入技术研究寄以厚望，我们的研究发现，这些方法作为导向和穿膜装臵的导入效率低、成本高昂、并影响治疗分子的效应，可能不具有临床前景。目前看来细胞内治疗，包括核酸和蛋白等大分子物质的细胞内转移，存在有许多需要解决的理论和技术问题，内防治心脑血管疾临床应用的设想可能过于前卫，还需要一段相当长时间的发展过程。（FEBS Letter 2001; 495: 16-20； Biochenology Leatters 2002, 24:851-855； Biochnology Letters 2003, 25:2117-2122; Cell Tissue Res (2004; 317:57-63)。 根据近几年RNA干扰技术和microRNA (miRNA)研究的迅猛发展，我们对这方面的研究作了相应跟踪，主要策略是利用内源性的miRNA能够通过与靶 mRNA 特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控的特性来抑制某些内源性心血管活性物质如内皮素、血管紧张素II 30