实验一、 酸性磷酸酯酶的提取分离纯化
一、目的
掌握胞内酶的分离提取方法，学会离心机的使用。 二、原理
酸性磷酸酯酶(Acid Phosphatase，E C 3 ．1．3．2)存在于植物的种籽、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一性地水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：
由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1微摩尔(μmo1)产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin一酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。本实验采用的是Folin-酚法。 实验前将绿豆芽细胞破碎，释放出酸性磷酸酯酶，离心除去细胞碎片和植物纤维等杂质，得到酸性磷酸酯酶的粗酶溶液，为下面的酶学性质研究及SDS-PAGE电泳法测分子量等系列生物化学实验做准备。 三、实验器材
1．LGl0—2.4A高速离心机：北京医用离心机厂生产，1台／组 2．托盘天平：1台／组。 3．滴管：1支／组。
4．100 mL烧杯：2只／组。 5．100mL三角烧瓶：1只／组。 6．漏斗：1只／组。 7．纱布：若干。 8．滤纸：若干。 9．碾钵：1套／组。 10．培养皿：1个／组。 11．100mL量筒：1支／组。 12．塑料手套：多双／组。 13．记号笔：公用。
14．绿豆芽：当日采摘，50克／组。 15.SephadexG-150均为pharmaeia产品。 四、实验试剂
1.0.01mol/LHAc一NaAc缓冲液： 2.0.2mol/LNaOH溶液
3.5.5mmol/LPNPP（对硝基苯磷酸二钠） 五、操作
1．匀浆：戴上手套，将绿豆芽掐去根和叶得绿豆芽茎，称取50 g的绿豆芽茎，在碾钵中用碾锤彻底捣碎，室温静置0.5 h，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。
2．平衡：将2只100mL烧杯分别放到托盘天平的2只托盘上进行平衡。将滤液倒人2支离心管中，再把离心管连同其盖子分别放入托盘上的2只烧杯中，用滴管增、减离心管中的溶液使其在托盘天平上进行平衡，平衡后盖上离心管的盖子，用记号笔做好标记。 3．离心：4 000 r／min离心20 min。 4．保存：将离心管中大部分上清液倒人量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后倒入三角烧瓶中．做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”在冰箱中保存备用。 5、将原酶液精确等分，一部分在冰箱中保存备用。另一部分用于实验六的sephadexG-150柱层析。
6.酶活力的测定
将pNPP溶于0.1mmol/LHAc-NaAc缓冲液中配成5.5mmol/L底物溶液，每lmL底物溶液
o
加入0.2mL酶液，37C保温1小时，再加入4mL0.2mol/LNaOH溶液终止反应，混匀后测405nm光吸收值。以先在底物溶液中加入4mL0.2mol/LNaOH溶液后再加入0.2mL酶液作对照。在此条件下，以每小时催化释放1umol对硝基苯酚的酶量定义为1个活力单位。 五、计算 上清液体积（mL） 粗酶液得率（mL）=上清液体积绿豆芽茎质量×100% 六、注意事项 1．使用离心机前必须将离心管(连同其盖子)精确平衡。
2．离心过程中，若听到异常响声，可能是出现了离心管破碎或离心管不平衡等情况，应立即切断电源，停止离心，检查原因
3．在离心机高速运转过程中切勿打开离心机盖，以防造成意外事故。
4．避免离心机连续使用时间过长，一般使用60 min后要隔20~30 min再使用。
5．有机溶剂会腐蚀离心管，酸、碱、盐溶液会腐蚀金属，若发现渗漏现象应及时擦洗干净．以免损坏离心机。 思考题
1．实验操作过程中为什么需戴上手套？
2．豆芽在碾钵中用碾锤彻底捣碎对酶液提取起到什么作用? 3．离心管中的沉淀物可能是哪些成分？
实验二、 酶促反应进程曲线的制作
一、目的
学会制作酶促反应的进程曲线，掌握可见分光光度计的使用。 二、原理
要进行酶的活力测定，首先要确定酶的反应时间。酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度范围内进行选择。要求出代表酶促反应初速度的时间范围就必须制作酶促反应的进程曲线。所谓进程曲线是指酶促反应时间与产物生成量(或底物减少量)之间的关系曲线。它表明了酶促反应随反应时间变化的情况。本实验的进程曲线是在酶促反应的最适条件下采用每间隔一定的时间测定产物生成量的方法，以酶促反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成的。从进程曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶促反应的初速度。但是，随着反应时问的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高使逆反应加强等原因所致。因此，要真实反映出酶活力的大小，就应该在产物生成量与酶促反应时间成正比的这一段时间内进行测定。换言之，测定酶活力应该在进程曲线的初速度时间范围内进行。制作进程曲线，求出酶促反应初速度的时间范围是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。
三、实验器材
1．VIS-7220型可见分光光度计 2．HH一2型数显恒温水浴锅
3．取样器：请参见实验一，5 mL、1mL。各1支／组。 4．试管：20支／组。 5．试管架：1个／组。 四、实验试剂
1．酸性磷酸酯酶酶液：取原酶液用0.2 mol／L的pH5．6乙酸盐缓冲液稀释10～20倍。 2．5 mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)：精确称取磷酸苯二钠(C6H6Na2PO4·2H2O，相对分子质量254.10)2.54 g，加蒸馏水溶解后定容至100mL，即配成了100 mmol／L磷酸苯二钠水溶液，密闭保存备用。用0.2mol／L的pH5.6的乙酸盐缓冲液稀释20倍，即得5mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)。
3．0.2 mol／L的pH5.6乙酸盐缓冲液。
4．Folin-酚试剂：于2 000 mL磨口回流装置内加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100 g，钼酸钠(Na2MoO4·2H 2O)25 g，水700 mL，85％磷酸50 mL，浓盐酸100 mL。微火回流10 h后加
入硫酸锂150 g，蒸馏水50 mL和溴数滴摇匀。煮沸约15min，以驱逐残溴，溶液呈黄色，轻微带绿色；如仍呈绿色，须重复滴加液体溴的步骤。冷却后定容到1000mL，过滤，置于棕色瓶中可长期保存，使用前，用蒸馏水稀释3倍。 5．1 mol／L碳酸钠溶液。 6．0.4 mmol／L酚标准应用液：精确称取分析纯的酚结晶0.94g溶于0.1mol／L的HCl溶液中，定容至1 000mL，即为酚标准贮存液，贮存于冰箱可永久保存，此时的酚浓度约为0.01mol／L。使用前将上述的酚标准贮存液用蒸馏水稀释25倍，即得到0.4 mmol／L酚标准应用液。 五、操作
检查试管是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。
1．加样与酶促反应：取试管12支，按0到11的顺序逐管编号，空白为0号。各管加0.5mL 5mmol／L磷酸苯二钠溶液，在35℃恒温水浴锅中预热2min后，在1～11管内各加入0.5 mL预热的酶液。酶液一加入立即精确计时井摇匀，按时间3、5、7、10、12、1 5、20、25、30、40和50min在35℃恒温下进行定时酶促反应(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加人时为终止时间)，参见图8—2一4。当酶促反应进行到上述相应的时间时，加入1 mol/L碳酸钠溶液5mL终止反应，时间控制详见表。 管号 1 2 9 3 8 4 7 5 6 6 5 7 4 8 3 9 2 10 1 11 0 酶液加入时刻10 （min 11号试管最先加样） 碳酸钠加入时刻（min） 13 14 15 17 18 20 24 28 32 41 50 2．显色：加完1 mol／L碳酸钠溶液5 rnL后再向试管中加入0.5mL Folin一酚稀溶液，混匀，保温约10 min即可显色。空白管所加试剂相同，但酶液最后加入。
3．测定：冷却后以0号管作空白，在可见光分光光度计上680 nnl波长处测定各管的吸光度A680。
酶促反应操作安排 管号 5mmol/L磷酸苯二钠溶液 酶液（35℃预热过的） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 0 各0.5ml 各0.5ml，一加入就计时，注意合理安排各管的加入时间，0 最好先加第11管，隔1min再加第10管（详见表8-2-1） 5 7 10 12 15 20 25 30 40 各5mL（用于终止反应） 各0.5mL 0号试管加入酶液0.5mL 35℃保温显色10min以上 A680 0
4．画图：以反应时间为横坐标，A680为纵坐标绘制进程曲线，并将其贴在实验报告上，由进程曲线求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围(直线部分涵盖的时间)。
5．清洁：将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计(尤其是比色槽内)、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报
50 35℃精确反应时间（min） 3 1mol/L碳酸钠溶液 Folin-酚稀溶液 告当场交给老师。 六、计算 试管 A680 1 2 3 4 七、注意事项
1．酶促反应应保持温和条件，反应液要避免剧烈搅拌或震荡。 2．实验前要设计好每支试管的加样顺序，确保反应时间的准确性。 3．酶促反应的加样顺序不得搞错，否则无法显色。 思考题 1．随着反应时间的延长，曲线的斜率不断下降，说明反应速度逐渐降低，这是为什么？ 2．如果酶促反应在一个较大的体系中，如在烧杯中进行，每隔一定的时间从烧杯中取样测定该体系中产物的生成量，并绘制酶促反应进程曲线，该方法和本书采用的方法结果会一致吗?哪个更好一些？
5 6 7 8 9 10 11 初速度的时间范围：0～ min