五、操作
检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120~C烘干。 1、酚标准曲线的制作
做过实验三的同学此步可免，直接应用上次的酚标准曲线。未做过实验三的同学，请按实验三中“标准曲线的制作”的操作，先制作酚标准曲线，保留该数据，以便实验四直接引用。
2、底物浓度对酶促反应速度的影响一一Km和Vm的测定
参见表取试管7支，按照0至6的顺序逐管编号，空白管为0号。1～6号管加入不同体积的5 mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH5.6)，并分别补充0.2mol／L的pH5．6乙酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min(先用烧杯盛35℃的水，置于水浴锅中，再将试管放入烧杯中保温，以防试管滑落水中,逐管加入35℃预热过的酸性磷酸酯酶酶液0.5 mL，开始计时，摇匀，精确反应10 min(酶液加入时为起始时间，碳酸钠溶液加入时为终止时间)。反应时间到达后立即加入5 mL1mol／L碳酸钠溶液，再加0.5 mL Folin酚稀溶液，摇匀，35℃保温显色约10min。
0号管内先加入0.5 mL 5 mmol／L磷酸苯二钠溶液(pH 5.6)，再加入5 mL l mol／L碳酸钠溶液和0.5 mL Folin-酚稀溶液，最后加入0.5 mL酶液，其他操作与1～6号管相同。冷却后以0号管作空白，在VIS一7220型可见分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度A680。
Km和Vm的测定
管号 5 mmol／L磷酸苯二钠溶液（mL） 1 2 3 4 5 6 0 0 0.5 0 暂不加 0.1 0.14 0.2 0.25 0.33 0.5 0.2mol／L的pH5．6乙酸盐缓冲液（mL） 0.4 0.36 0.3 0.25 0.17 35℃预热2min左右 35℃预热过的酶液（mL） （加入就计时，即起始时刻） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 摇匀，在35℃的条件下，精确反应10min（注意合理安排各试管的酶液加入时间，也就是反应的起始时间，最好间隔1min） 各管内均加入1mol／L碳酸钠溶液5mL（用于终止反应） 各管内均加入Folin-酚稀溶液0.5mL，摇匀 向0号管加入酶液0.5mL 摇匀，所有试管在35℃保温显色10min以上 A680 0
用各管的A680在标准曲线上查出其对应的酚标准应用液的毫升数V，则产物的浓度为0 .4×V(mmol／L)，这样，各种底物浓度下的速度v=0.4×V／10(mmol／(L·mL·min))，取相应的倒数，填表8-4-2内。以l/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，求出Km和Vm。
3、将用过的玻璃仪器和取样器套头洗净，清洁分光光度计(尤其是比色槽内)、清洗比色皿，整理好桌面上的仪器和试剂，井注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。
六、计算
记录与计算汇总 管号 A680 V（mL） 1 2 3 4 5 6 磷酸苯二钠浓度（mmol/L) 1/[S] 反应时间（min） 反应速度v（mmol·mL·min 1/v Kn Vn 0.5 2.0 10 0.7 1.42 10 1.0 1.0 10 1.25 0.8 10 1.65 0.6 10 2.5 0.4 10 七、注意事项
参见实验二之注意事项。 思考题
1．为什么要用双倒数作图法而不是直接用米氏曲线来求米氏常数? 2．还有其他作图法可以准确求出米氏常数吗?试用本实验的数据，通过两种作图法来求米氏常数，并比较差异。
实验七、 酸性磷酸酯酶的检测——SDS-PAGE电泳法
一、目的
熟悉垂直板型电泳槽的使用，了解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量以及检测样品中蛋白质组分的一般原理，掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法。 二、原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N，N一亚甲基双丙烯酰胺(N，N methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N’，N’四甲基乙二胺(N，N，N’，N’tetramethyl ethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(anmonium persulfate(NH4)2S208，简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2)的作用下集合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(pelyacrylamide geI elec trephoresls，简称PAGE)。 用普通凝胶电泳分离大分子物质，主要依赖于各大分子所带电荷的多少、相对分子质量的大小及其分子的形状等差异。而要利用凝胶电泳测定大分子的相对分子质量，就必须将大分子所带电荷和分子形状的差异所引起的效应去掉或将其减少到可以忽略不计的程度，从而使大分子的迁移率完全取决于它的相对分子质量。 为了达到上述目的，目前较常用的方法是在电泳体系中加入一定浓度的十二烷基磺酸钠(Sodium dedecylsufate，SDS)。SDS是一种阴离子表面活性剂，它能破坏蛋白质分子的氢键和疏水键，使蛋白质变性为松散的线状，在强还原剂β一巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成组成它们的多肽链，解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。蛋白质SDS复合物所带的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异，而且此复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒，它的短轴对不同的蛋白质亚基SDS复合物基
-8
本上是相同的，约为180A (1.8×10m)，但长轴的长度则与蛋白质亚基相对分子质量的大小成正比，因此这种复合物在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和分子形状的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质亚基相对分子质量的大小。当蛋白质的相对分子质量在1 2 000～200 000时，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系：
lgMw=-b*mR+K
式中Mw——相对分子质量； mR——相对迁移率； b——斜率； K——常数。
实验证明，相对分子质量在12 000~200000的蛋白质，用此法测得的相对分子质量，与用其他方法测得的相对分子质量相比，误差一般在土l0％以内，重复性高。此方法还具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优点，现已成为测定某些蛋白质相对分子质量的常用方法。值得提出的是，此方法虽然适用于大多数蛋白质相对分子质量的测定，但对于一些蛋白质，如带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白)、结构蛋白(如胶原蛋白)、电荷异常或构象异常的蛋白质(如组蛋白F1)和一些含二硫键较多的蛋白质(如一些受体蛋白)等是不适用的，因为它们在SDS体系中，电泳的相对迁移率与相对分子质量的对数不呈线性关系。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性．机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； (3)对pH和温度变化较稳定；
(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； (5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达6～10μg；
(6)凝胶孔径可调节．根据被分离物的相对分子质量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度的选择与被分离物质的相对分子质量密切相关，本实验采用垂直平板形式以不连续系统的SDS_聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，凝胶浓度为10％。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成，浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6．8的Tris—HCl。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.8Tris—HCl。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH使不连续体系形成了凝胶孔径、pH、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS_PAGE电泳不仅能测定未知蛋白质的相对分子质量，也能检测样品中蛋白质的组成情况，根据电泳图谱中区带的存在与否、色泽深浅以及所处的相对分子质量范围，可以判断样品中是否含有某种蛋白质，有哪些杂蛋白组分，各蛋白质组分的相对含量等信息。本实验采用SDS不连续系统垂直板型电泳检测从绿豆芽中提取的粗酶溶液中酸性磷酸酯酶以及杂蛋白的组成情况。酸性磷酸酯酶的相对分子质量为55000土5000 三、实验器材
1 DYY-Ⅲ-4型常压电泳仪：北京市六一仪器厂生产 2 DYCZ-24E电泳槽 3 DYCZ-24E制胶装置
4 HH—2型数显恒温水浴锅
5取样器1 mL、5 mL各1支／组。
6 PHS-3C型pH计；上海雷磁仪器厂生产，配试剂时教师使用 7 100mL小烧杯：2只／组。 8电炉：公用。
9 500mL烧杯：公用。
10泡沫架(3孔)：1个／组。 11不锈钢镊子：公用。
1 2 100uL微量注射器：1支／组。 13透明塑料饭盒：1只／组。 14 Eppendorf管：公用。
15洗瓶(内装重蒸馏水)：1只／组。 16药勺：1支／组。 17刀片：1片／组， 18．脸盆：1个／组。 四、实验试剂
1．0.5 mg／mL的Marker标准蛋白质溶液：称取低相对分子质量的标准蛋白质Marker样品0.5 mg放人洁净的1.5 mL的Eppendorf管中，加入1mL“1×样品稀释液”(即“2×样品稀释液”再稀释1倍的产物)，使之溶解，再按每管100uL分装，贮存于-20℃冰箱中备用。
2．凝胶贮液：30 g丙烯酰胺，0．8 g亚甲基双丙烯酰胺，溶于100mL重蒸馏水，于4℃
暗处贮存，一个月内使用。
3．lmol／L pH8．8的Tris—HCl缓冲液：Tris l21 g溶于重蒸馏水，用浓HCl调至pH8．8，以重蒸馏水定容至1 000 mL。
4．0.5 mol／L、pH6．8的Tris~HCl缓冲液：仿3配制。
5．10％(w／v)SDS：10 g的SDS定容于100 mL重蒸馏水中，SDS用分析纯，南京凯基生物科技发展有限公司生产，如是化学纯则需处理。
6．10％(w／v)过硫酸铵溶液(使用当天现配现用)：10 g过硫酸铵定容于100mI。重蒸馏水中。
7．四甲基乙二胺(TEMED)。
8．电极缓冲液(pH8.3)：Tris 30.3 g，甘氨酸144.2 g，SDS 10 g，溶于重蒸馏水并定容至1000 mL，使用时10倍稀释。
9．2×样品稀释液：SDS 500 g、β-巯基乙醇1 mI，、甘油3 mI。、漠酚蓝4 mg、1／L—pH6.8 Tris~HCl 2 mL，用重蒸馏水溶解并定容至10 mL，，按每份l mL分装于Eppendorf管中，一20℃贮存。此液制各样品时，样品若为固体，应稀释l倍使用；样品若为液体，则加人与样品等体积的原液混合即可。
10．固定液：500mL乙醇，100mL冰醋酸，用重蒸馏水定容至1 000 mL。 11．脱色液：250mL乙醇，80mL冰醋酸，用重蒸馏水定容至1 000 mL。 12．染色液：0.29 g考马斯亮蓝R250溶解在250mL脱色液中。 13．自制的粗酶溶液。 五、操作
1，制板：用酒精棉球擦拭制胶槽、玻璃板和盖板，并将其晾干。 将制胶玻璃板按照平、凹、平、凹顺序放人制胶槽内，一共放4套，盖上有机玻璃盖板，用四支夹子夹紧，受力点在密封条位置，务必密封，以防漏胶。 2，制胶
(1)制10％的分离胶
在小烧杯中，按表8—5—1的配方和顺序配制l0％浓度的分离胶，总量应根据制胶装置的大小而决定，本实验中45 mL左右，可制作4块胶。分离胶液混匀后，迅速用5 mL取样器吸取胶液，加至任意一个平、凹玻璃板间的间隙中，注意使胶液顺着凹面玻璃板的表面流下，加胶要迅速，由于4个平、凹玻璃板间的间隙是通过制胶槽底部的通道相通的，所以4个间隙中的液面会同时上升，当分离胶液面距离平面玻璃板顶端约2 cm处时停加胶液，参见图8—5—5。再用1 mL取样器向4个胶的液面上分别注入1 mL重蒸馏水，利用水的压力平衡分离胶的被面，使分离胶压制成一条直线，并且用于隔绝空气，在室温下放置40min左右，分离胶即可完全凝聚。然后把水倒掉，可见清晰的线状的分离胶液面。
注意：注入重蒸馏水时要快，避免产生过大的压力差，保证各分离胶液面等高。
10%分离胶配制方法 试剂 凝胶贮液 1mol/LpH8.8Tris-HCl 重蒸馏水 10%SDS TEMED 10%AP（过硫酸铵） 合计 体积（mL） 15 16.8 13.05 0.45 0.03 0.15 45.48