于它的静水压。静水压是指洗脱瓶中洗脱液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力（或接触空气的两个液面间的高差），这个高度差越大，静水压越大，洗脱液的流速就越快。这个压力差可以调动，如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减；或者降低或提高层析柱出口的位置等，因此静水压又称操作压。
由于静水压越大，洗脱液的流速就越快。在固定洗脱瓶与出口位置的情况下，静水压会在洗脱过程中，随着洗脱瓶中溶液减少液面不断下降而减少，难以维持流速的恒定。为了解决这个问题，Marriotte首次将洗脱瓶加塞塞紧，塞中插入玻璃管，使玻管下口深入到洗脱液的底部，这样洗脱液的静水压便等于此玻管下口的液面高出层析柱出口液面的高度（因为当洗脱瓶液体流出时，瓶顶形成真空，空气只从玻璃管中进入，玻管下口即为接触空气点），因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增减将不影响静水压，从而自动保持了流速的恒定，此洗脱瓶称为恒压瓶，也叫马氏瓶。当然，当洗脱液减少至液面低于玻管的下口时，便会失去作用，但这时可用及时加入洗脱液来解决。
在凝胶层析中，不仅要保持静水压的恒定，还要保持适当的静水压。这是因为G–75以上的软胶胶体柔软易变形，对静水压仅有一定的承受能力，不同软胶的承受能力也不相同，静水压超过凝胶的承受能力时，最初流速会很快；其后随着静水压力过大将使软胶变形压紧，流速逐渐降低，最后甚至流不出。所以，保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结果的必要条件。
脱盐一般使用的是G–25属于硬胶，硬胶不易变形，受静水压的影响较小，实验过程中的流速可用恒压瓶下口橡皮管上的螺旋夹控制在0.5ml/min左右，随着洗脱液的流出，样品逐步被分开。用试管收集洗脱液，按顺序每管收集2ml。
（6）检测 在收集的同时，检查蛋白质是否流出。以光密度值为纵坐标，以收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图。可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线，用以表示被分离物质流出的状态。
（7）凝胶的洗涤及保存 由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需“再生”，只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。
凝胶暂时不使用可浸泡在溶液中，存放在4℃冰箱中。若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可使用。凝胶长期不用，可用水洗净，分次加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之平衡，再换一下浓度的乙醇，让凝胶逐步脱水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或将凝胶洗净后抽干，在表面皿上30℃逐步烘干。
三．试剂与器材
１、凝胶过滤柱（1.0*60cm） ２、层析柜 ３、紫外检测仪 ４、恒流泵
５、馏分自动收集器 ６、记录仪
７、葡聚糖凝胶G-150
四．实验步骤
取Sephadex G-150 25g于500ml水中，煮沸5小时，得到溶胀完全的凝胶。
取30cm的层析柱，垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀好的Sephadex G-150中的水倾倒出去，加入2倍体积的0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-150，使凝胶自然沉降，关闭出口。
待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.01mol/L，pH5.0的醋酸缓冲液以3倍柱体积的醋酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。
凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将粗酶液样品1.5ml（浓度尽量大一点，可用反相透析法浓缩酶液，加样量约为柱体积的2%~5%）加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.01mol/L，pH5.0的醋酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。用试管收集洗脱液，每管3ml。
在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。当检测器和记录仪中的数值开始变化时用记号笔标记管号。当数值重新恢复到“0”值时层析结束。整理记录仪上的记录纸，进而确定含有目的酸性磷酸酶的试管。收集试管，重复【实验三 酸性磷酸酯酶的酶活力测定】，确定各管酶活力的变化，绘制酶活曲线。同时将记录纸上的曲线绘制到实验报告之上，即为蛋白曲线。
将具有酶活力的试管合并，用考马斯亮蓝法检测其中的蛋白含量，同时测量酶活力，得出单位质量的酶活。与粗酶液比较纯化前后单位质量的酶催化活性的变化。
五．注意事项
①装柱后，凝胶要始终处于缓冲液浸泡中，液面不能低于凝胶。加样时尤其要注意。 ②保持凝胶表面水平，没有凹陷或凸起。洗脱液必须沿凝胶柱管壁流到液面，不能滴到液面上，防止凝胶变形。
③由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需“再生”，只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。
六．思考题
①画出层析装置的连接示意图。 ②常用于凝胶层析的凝胶都有哪些？ ③查找资料，阐述一下层析的分类。
实验五 考马斯（Comessie)亮兰结合法测定蛋白质浓度
一． 目的
掌握考马斯亮蓝法检测蛋白含量的方法。 二．原理
考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250 的最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮兰G250-蛋白质定量测定的高敏性度。
在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物呈青色。在595nm下，光密度与蛋白质 含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。
优缺点：
(—)操作简便、快速；检测灵敏；重复性好。
(二)显色迅速。约于2分钟内完成染料与蛋白质的结合。所现颜色至少在l小时内是稳定的。
(三)与改良Lowry氏法相比，干扰物质较少。
(四)当样品中存在较大量的十二烷磺酸钠(SDS)、Triton X-100等去垢剂时，显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色，故必须预先处理样品。
(五)考马斯亮兰G250染液不宜久存，以1-2月为宜。
(六)微量法测定蛋白含量范围为1-10μg；常量法测以检测范围10-100／μg为宜。 三．器材
(一)试管l0支
(二)吸管10ml、l5ml、lml、O.1ml各1支。 （三）721分光光度法，普通比色杯4只。 四．试剂
(一)O.9％NaCl
(二)待测粗酶液和层析后酶液 (三)标准蛋白
(四)染液：考马斯亮兰G250 0.1克溶于0.5 m1 95%乙醇。再加入100m1 85％(W／V)磷酸。然后加蒸馏水定容到1000ml。[此时溶液为0.0l％考马斯亮兰G250／4.7％(W／V)／乙醇／8.5%(W／V)磷酸]。 五．操作(常量法)
(一)标准曲线制备：
配制lmg／ml的标准蛋白溶液。制备系列稀释液，其浓度分别为1000μg／ml，500μg／ml， 250μg／ml，125μg／ml ，62.5μg／ml和31.25μg／ml。
按下表操作：
摇匀，室温静置3分钟。在第一管为对照管，在721型分光光度计于波长595nm处比色-读取光密度。以各管光密度为纵座标，各标准样品浓度(μg／ml)作为横座标作图得标准曲线。
(二)未知样品测定： 取样品稀释不同倍数，分别测量吸光度，最后选择落在标准曲线范围内的稀释倍数进行计算。
取试管二只，按下表操作：
摇匀，静置3分钟，在721型分光光度计亡波长595nm比色，读取光密度，查标准曲线，求得稀释样品蛋白质浓度。
【计算】
未知样品蛋白质浓度μg／ml＝稀释样品浓度×稀释倍数
实验六 酸性磷酸酯酶米氏常数的测定
一、目的
掌握米氏常数(Km)及最大反应速度(Vm)的测定原理和实验方法，掌握可见分光光度计的使用。 二、原理
请参见实验一
根据酶与底物形成中间配合物的学说，可以得到一个表示酶促反应速度与底物浓度之间相互关系的方程式，这就是酶学上著名的米氏方程：
式中。[S]为底物浓度，v为反应速度，Vm为最大反应速度，Km为米氏常数。由米氏方程可以推出，米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，米氏常数的单位就是浓度单位(mol／L或mmol／L)。
测定Km和V m，特别是测定Km，是酶学工作的基本内容之一。在酶动力学性质的分析中，米氏常数Km是酶的一个基本特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱，Km数值越大，说明酶与底物的亲和力越弱；反之，Km值越小，说明酶与底物的亲和力越强，Km值最小的底物就是酶的最适底物。
测定Km和Vm，一般通过作图法求得。作图方法很多，其共同特点是先将米氏方程式变换成直线方程，然后通过作图法求得。本实验在测定酸性磷酸酯酶以磷酸苯二钠为底物的Km和Vm时，采用最常用的双倒数作图法(Lineweaver-Burk作图法)。这个方法是先将米氏方程两边同时取倒数，整理后得到：
然后以1/v对1/[S]作图，可得到一条直线。这条直线在横轴上的截距为1/Km，在纵轴上的截距为1/Vm，由此即可求得Km和Vm
三、实验器材 请参见实验二 四、实验试剂 请参见实验二