微生物工程实验指导
实验一：接种工具的认识与使用
实验二：比浊法测定发酵液中大肠杆菌浓度 实验三：测定菌体干重
实验四：发酵过程中糖的利用 实验五：淀粉产生菌的初筛 实验六：淀粉酶活力的测定 实验七：生产菌株发酵条件优化 实验八：发酵污染的检测与判别 实验九：乳酸菌的分离纯化与鉴别 实验十：酸乳及酸乳饮料的制作 实验十一：反应器设备的原理及使用 实验十二：反应器电极的使用 实验十三：抗生素产生菌初筛
实验一：接种工具的认识与使用
一、 实验目的
1. 认识接种工具，学会使用方法，学习包扎接种针、移液管及灭菌方法。 2. 学习接种的基本技能 二、 实验原理
接种是发酵技术的最基本操作，微生物的传代和扩大培养都需要接种或移种。接种是指将微生物接到适合于其生长的营养物上使微生物繁殖的操作。移种是指将已培养好的液体培养物转接到新鲜的液体培养基中，使其进一步扩大培养和生长繁殖的操作。接种工具常用的有接种针、接种环、接种铲，移液管等。
接种和移种是将已培养好的菌种转接到新鲜培养基的过程，不同的菌，采用不同的接种方法。一般细菌和酵母菌由于菌落比较湿润，容易粘附到接种工具上，因此可以用接种针或接种环接种；而放线菌和霉菌的菌落比较干燥，不容易粘附在接种工具上，因此用接种铲产起斜面表层的一块菌苔作为接种物。接种过程是一个无菌过程，接种工具、接种环、接种环境以及培养基都应该保证无菌条件。
三、 试剂与器材
接种针、接种环、移液管、棉花、牛皮纸、试管斜面培养基、液体培养基 四、 实验操作
1. 认识接种针、接种环
2. 接种针、接种环的包扎和灭菌 3. 移液管的认识和包扎 4. 接种与移种
A两斜面之间的接种方法
(1)贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口约2-3cm的位置。(若用记号笔标记则不需标签)。 (2)点燃酒精灯。
(3)接种 用接种环将少许菌种移接到贴好标签的试管斜面上。操作必须按无菌操作法进行。简述如下：
1)手持试管 将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面面向操作者，并使它们位于水平位置(图2-11)。
2)旋松管塞 先用有于松动棉塞或塑料管盖，以便接种时拔出。
3)取接种环 右手拿接种环(如握钢笔一样)，在火焰上将环端灼烧灭菌。然后将有可能伸入试管的其余部分均灼烧灭菌，重复此操作，再灼烧一次。
4)拔管塞 用右手的无名指、小指和手掌边先后取下菌种管和待接试管的管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)。见图2-12(a)所示。 5)接种环冷却 将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。
6)取菌 待接种环冷却后，轻轻沾取少量菌体或胞子，然后将接种环移出菌种管，注意不要使接种环的部分碰到管壁，取出后不可使带菌接种环通过火焰。见图2-12(b)所示。
7)接种 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，切勿划破培养基。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条直线作斜面接种，直线接种可观察不同菌种的生长特点。
B 斜面转接摇瓶液体培养基 1. 接种环接种 2. 移液管接种
种子培养物转接发酵摇瓶 1）
用右手的无名指、小指、和手掌夹住种子瓶的棉塞，轻轻拔出，
将瓶口过火后移开，但使瓶口仍靠近并面向火焰。 2）
将移液管伸入种子摇瓶培养物中吸出要求量的培养物，食指按
住移液管顶部，小心取出吸管。 3）
用右手的无名指、小指和手掌夹住发酵摇瓶的纱布塞，轻轻拔
出，将摇瓶过火后移开，但使瓶口仍靠近并面向火焰。 4）
将带有菌体的移液管伸入待接种的摇瓶，放松吸管顶部，接入
种子液，取出移液管，放入消毒水中。 5）
摇瓶口包上纱布，放恒温摇床培养。
5.
五、 思考题
灭菌后如果比较湿对接种有没有影响，怎么办？
实验二： 比浊法测定发酵液中大肠杆菌浓度
一、 实验目的
学会比浊法测定发酵液中以单个细胞的分离形式存在的微生物浓度的方法。 二、 实验原理
大肠杆菌和酵母菌等在发酵液中以单个细胞的分离形式存在的微生物可以采用测定浊度的方法确定菌浓。具体方法是将发酵液适当稀释后，使用可见分光光度计在波长600～660nm下测量发酵液吸光度，为了保证测定的准确性，吸光度值应在0.2～0.7之间，可以通过适当稀释发酵液来实现。 三、 器材与试剂
培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 5,pH7.2 摇瓶装量20%。37℃摇床恒温培养10～12h。 分析测定仪器：可见分光光度计 四、 实验操作
1. 取10支试管，分别在其中加入5ml，2.5ml，1.0ml，0.5ml，5、0.1ml大
肠杆菌培养液。每支重复一次。
2. 顺序在其中加入0ml，2.5ml，4.0ml，4.5ml，4.9ml去离子水，分别稀释
1、2、5、10、50倍。
3. 以去离子水为参比，在波长600nm比色，测定吸光度值。 五、 数据记录
读取并记录每一次数据。
稀释倍数 1 2 5 10 50 A600
A600×稀释倍数
计算：菌浓= A600×稀释倍数
实验三：：测定菌体干重
一、 实验目的
学会测定菌体干重的方法，以及分析菌体干重与比浊法测定的吸光度之间的关系。
二、 实验原理
在不含固体的培养液中培养微生物，发酵液中的固体全市菌体，因此可以首先离心得到湿菌体后，用适当的方法干燥，得到干菌体的量可直接反映菌体生长的多少。 三、 器材与试剂
培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏10，NaCl 5,pH7.2 分析测定仪器：恒温干燥箱，分析天平 四、 实验操作
1. 将2个干燥的10ml离心试管放入95℃烘箱烘2h取出，放入干燥器，待
试管冷却后称重得到m空1，m空2
2. 在两试管中分别准确加入10ml发酵液，注意发酵液需摇匀。
3. 放入离心机离心，3000r/min，离心15min，注意：离心之前要将预离心
的试管平衡并对称放入离心机，以免损坏离心机。 4. 同时测定该发酵液的A600值。
5. 离心毕，拿出试管，弃去上清液，将试管和其中的菌体放入95℃烘箱烘
干12h。
6. 取出试管，放入干燥器，待冷却后称重，得到m菌1，m菌2。 五、 数据记录
记录：m空1，m空2, m菌1，m菌2, A600 计算：m空均=（m空1+ m空2）/2 m菌均=（m菌1+ m菌2）/2 菌体干重= m菌均- m空均
单位菌体干重=菌体干重×1000/10（g/L）
菌体干重除以A600即得到二者的对应关系。在测定发酵过程的菌浓变化时，只要测得A600就可以计算出菌体干重。