实验四：发酵过程中糖的利用
一、
1. 2. 二、
实验目的
了解发酵过程中碳源的利用规律。
掌握用邻甲基苯胺法测定糖含量的方法。 实验原理
糖类是微生物生命活动中主要的碳源和能源物质。一方面，微生物的生长需要糖类，另一方面，糖也构成了代谢产物中碳架的主体。所以在发酵过程中，糖的消耗是一项重要的生理指标，是判断发酵进程的主要依据。
糖的定量测定方法很多。如斐林试剂法、碘量法、蒽酮比色法、3,5-二硝基水杨酸法等，它们各有优缺点。本实验采用邻甲基苯胺法测定。该法的特点是反应灵敏，操作简便，结果准确，稳定性好。
邻甲基苯胺是一种芳香族伯胺，可与醛基反应生成希夫碱。在酸性溶液中，邻甲基苯胺与葡萄糖的醛基作用，生成葡萄胺和相应希夫碱的混合物。这一混合物呈绿色，颜色稳定，其深浅与葡萄糖的浓度呈正比，在一定范围内符合比耳-朗伯特定律，因此可用于测定还原糖的含量。 三、 实验器材和试剂 1. 器材
721分光光度计，移液管，容量瓶，试管等。 2. 试剂
（1） 标准葡萄糖溶液：取分析纯葡萄糖置于105℃烘箱干燥2h，精确称取20mg，
溶解后置于100ml容量瓶内，用蒸馏水定容至刻度，配成0.2mg/ml的标准溶液；
（2） 邻甲基苯胺试剂：称取硼酸0.65g,溶于温热的210ml冰醋酸中，再加入
1.25g硫脲，充分溶解后加入邻甲基苯胺37.5ml,用冰醋酸定容至250ml，储存与棕色瓶内；
（3） 2mol/l HCl和2mol/l NaOH。 3. 发酵液
四、 实验步骤
1. 葡萄糖标准曲线的制作
（1） 取干净试管6支，按下表加入各溶液；
（2） 将各试管内溶液摇匀，套上试管帽，置于沸水浴中加热10min； （3） 取出，用流水冷却至室温；
（4） 用分光光度计在波长635nm下比色，读取吸光度，将结果填入表中； （5） 以吸光度为纵坐标，糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
葡萄糖标准曲线的制作 1 2 3 4 5 6 管号
0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 葡萄糖/mg
0.25 0.5 1.0 1.5 2.0 标准葡萄糖溶液/ml 0
2.0 1.75 1.5 1.0 0.5 0 蒸馏水/ml
4 4 4 4 4 4 邻甲基苯胺试剂/ml
A635
2. 发酵液含糖量的测定
（1） 酸解：如果发酵培养基内含有双糖或多糖，应先将它们水解成单糖，然后
进行测定。测定时发酵液先用滤纸过滤。取发酵中的发酵滤液2ml，置于干净试管中，加入2mol/l HCl 2ml，摇匀，套上试管帽，置于沸水浴内水解25min,使双糖或多糖水解为单糖；
（2） 稀释：水解液用2mol/l NaOH调至中性，然后全量倒入100ml容量瓶中，
用蒸馏水冲洗水解液，合并洗液，并定容至刻度，充分摇匀；
（3） 显色：吸取稀释后的水解液2ml，置于干净试管中，再加入邻甲基苯胺试
剂，充分摇匀，套上试管帽，置沸水浴加热10min。取出后用流水冷却至室温；
（4） 比色：以2ml蒸馏水代替水解液作对照管，在635nm波长下测定吸光度； （5） 计算:根据样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的葡萄糖毫克数，然
后按下列公式算出每100ml发酵液中的含糖量。 发酵液含糖量（g/100ml）=[(A×N)/(V×1000)]×100 式中：A为由吸光度查标准曲线所得糖毫克数； N为样品稀释倍数；
V为测定时所取的样品毫升数。 五、 注意事项
1. 葡萄糖必须经过干燥才能配成标准溶液，否则误差较大。 2. 试管必须洗干净，不能留有残糖。
实验五：淀粉酶产生菌的初筛
一、实验目的
学习淀粉酶产生菌的筛选方法。 二、 实验原理
淀粉酶在酿造、纺织、食品加工、医药等领域具有广泛的用途。可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。本实验以淀粉酶产生菌的筛选为例，介绍发酵菌种的初步筛选。 三、 实验器材与试剂 1.菌株
土壤、水、湖泊沉积物或其他富含微生物的样品 2.培养基
（1）淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，可溶性淀粉0.2%，琼脂2%，pH7.2～7.4
（2）高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g ,K2HPO4 0.5g ,MgSO4·7H2O 0.5g ,NaCl 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,琼脂20g，加水至1000ml，pH7.2～7.4 3.器材
高压蒸汽灭菌锅，恒温干热灭菌箱，超净工作台，天平，电炉，1 mol/L HCL, 1 mol/LNaOH, pH试纸、量筒，玻棒，三角瓶，玻璃珠，试管，培养皿，移液管等 四、 实验步骤 1. 培养基的制备
通过称量、溶解、调节pH等步骤，配制上述培养基，并配制45ml无菌水（内装几颗玻璃珠）一瓶，4.5ml无菌水若干支，0.1MPa灭菌30min后备用；另包扎好培养皿、移液管和涂布棒等，灭菌，烘干备用。 2. 倒平板
将灭菌后的培养基冷却至50～60℃，以无菌操作法倒至经灭菌并烘干的培养皿中，每皿约20ml。为了防止非目的菌株的生长，可在细菌和放线菌培养基中加入制霉菌素使之达到100mg/L，以抑制真菌生长。冷却凝固待用。 3. 微生物分离（涂布法）
（1） 称取样品5g，放入装有45ml无菌水的三角瓶中，震荡10min，即为10-1
的土壤稀释液。
（2） 取4.5ml无菌水4支，用记号笔编上10-2、10-3、10-4、10-5。
（3） 去10-1的稀释液，震荡后静止2min,用无菌移液管吸取0.5ml上层细胞悬
液加至装有4.5ml无菌水的试管中，制成10-2稀释液。同法依次稀释至10-3、10-4、10-5稀释液。在稀释过程中，因从高浓度到低浓度，每稀释依次应更换一支移液管。
（4） 另取移液管，分别以无菌操作法吸取10-5，10-4，10-3的稀释液0.1 ml，加
至制备好的平板上，用涂布棒涂布均匀。从低浓度到高浓度，可以用同一根移液管或涂布棒。
（5） 将培养皿倒置培养于恒温培养箱中，30℃培养5～7d后观察。 （6） 根据菌落形态特征，挑取有代表性的单菌落，在相应的培养基平板上划线，
直至得到纯培养。纯化后的菌株应及时转接到斜面培养基上保存。
4.分离纯化的菌株可点种与淀粉培养基平板上（每皿点种5点），形成菌落后，
在平板上滴加卢哥碘液，以铺满平皿为度，如果菌落周围有透明圈出现，说明淀粉被水解，该菌能产生淀粉酶，透明圈与菌落直径之比越大，说明淀粉酶活力越强。
五、思考题
分离设计时应怎样安排较为合理，是多皿一次分离为佳，还是少皿多次为佳？
实验六：淀粉酶活力测定
一、 实验目的
1. 掌握分光光度法测定液化性淀粉酶活力的基本原理和方法。 2. 从初筛所获的菌株中筛选出淀粉酶活力高的菌株。 二、 实验原理
淀粉酶（amylase）是指能催化分解淀粉分子中糖苷键的一类酶，包括α－淀粉酶，β－淀粉酶，糖化酶和异淀粉酶。α－淀粉酶可从淀粉分子内部切断淀粉的α－1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，使淀粉的粘度下降，因此又称为液化性淀粉酶。
淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉-碘复合物在660nm处有较大的吸收峰，可用分光光度计测定。随着酶的不断作用，淀粉长链被切断，生成小分子糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时间内蓝色消失的程度为指标来测定α－淀粉酶活力。 三、 实验器材与试剂 1. 菌种
实验五中筛选到的α－淀粉酶产生菌。 2. 培养基（w/v）
豆饼粉5%，玉米粉7%，Na2HPO4 0.8%,(NH4)2SO4 0.4%,NH4Cl 0.15%,用自来水配制。250ml三角瓶中装培养基25ml，8层纱布封口，0.1MPa灭菌30min。 3. 试剂
（1） 碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后
定容至500ml，贮于棕色瓶中；
（2） 比色用稀碘液：取原碘液2ml，加碘化钾20g,,用蒸馏水定容至500ml，
贮于棕色瓶中；
（3） 2%可溶性淀粉：称取可溶性淀粉（干燥至恒重）2g,用少量蒸馏水混
合调匀，徐徐倾入煮沸的蒸馏水中，边加边搅拌，煮沸2min后冷却，加水定容至100ml。需当天配制。
（4） pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠4.523g，柠檬酸
0.807g，用水溶解并定容至100ml;
（5） 标准糊精溶液：称取纯糊精0.06g，悬浮于少量水中，调匀后倾入90ml
沸水中，冷却后加水定容至100ml。加几滴甲苯防腐，冰箱保存；
（6） 0.5mol/l乙酸溶液，0.85%生理盐水。 4. 器材
恒温水浴锅、白瓷板、分光光度计等。 四、 实验步骤 1. 摇瓶培养
挑取经活化后的斜面菌苔3环，悬于5ml无菌生理盐水中，吸取0.5ml接入上述培养基中，30℃摇瓶培养（180r/min）。每隔8h取出一瓶，将发酵液过滤后直接作为粗酶液。 2. 酶液稀释
用pH6.0缓冲液将粗酶液做适当稀释。 3. 标准曲线的制作
（1） 将可溶性淀粉稀释成0.2%，0.5%，1%，1.5%，2%的稀释液；