宏基因组分析法是直接依据基因或基因组、蛋白质序列，以及其调节表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用。即通过对未培养微生物的宏基因组分析(metagenomicanalysis)来利用未培养微生物的基因资源，这一方法可以不经过对未培养微生物的纯培养过程，而直接在基因水平上开发利用未培养微生物。通过构建未培养微生物群落的集群基因组(collective genomes)，并对其进行测序，得到各组成微生物的基因组序列，结合蛋白质组学的研究结果，采用比较基因组学(comparative genomics)的方法鉴定存在于各物种的所有基因。这可以使人们详细了解未培养微生物、极端微生物的新的代谢途径、基因表达的调控机制，找到病原、抗性等基因，并发现新的基因等。这些信息不仅可以使人们认识基因和物种进化的过程，以及未培养物种的组成及其系统发育关系，而且还可以让人们了解其生态学功能、确定其生态位，为准确设计培养基和培养条件，以便最终获得其纯培养奠定了基础。这些工作都为未培养微生物的开发利用开辟了极为广阔前景。 尽管人们对未培养微生物的研究已取得一定进展，但对它们的形态、生理特性、代谢功能，以及它们对环境的影响等，难以进行实验研究。因此，目前成功应用未培养微生物的例子还不多。已有不少学者致力于新的分离培养技术的探索，突破传统的概念，建立新的方法，获得过去未曾发现的新的微生物种类，例如发现了利用有毒的电子传递物质的类群、微小的纳米级的细菌等。这些都为以后更好地利用未培养微生物奠定了基础。目前研究较多的是诸如油层、环境污水及火山口、温泉等极端环境中的未培养微生物。 3、发酵菌种的选育、保藏和复壮
在发酵工程领域，围绕发酵菌种，主要涉及以下4个方面： 1）选种
选种即选择符合发酵生产要求的菌种。菌种的来源有两个途径，一是直接向科研单位、高等院校、发酵工厂或菌种保藏单位购买；二是从自然界中分离筛选菌种。 2）育种
育种即按照发酵生产的要求，根据微生物遗传变异理论，对现有的发酵菌种的生产性状进行改造或改良，以提高产量、改进质量、降低成本、改革生产工艺。育种技术包括自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种、基因工程定向育种。其中基因工程定向育种是现代育种技术的标志。 3)菌种保藏
原理：菌种保藏即选择不同发酵菌种的适宜的保藏方法，保持菌种较高的存活率，避免菌种的死亡和生产性状的下降，防止杂菌污染，在适宜条件下，菌种可重新恢复原有的生物学活性而进行生长繁殖。
方法：菌种保藏的主要方法包括斜面低温保藏法（定期移植保藏法）、液体石蜡封存法、干燥保藏法(主要有沙土管或滤纸条保藏法、真空干燥法、真空冷冻干燥法)、液氮超低温保藏法。研究表明，酵母菌发酵菌种采用定期移植保藏法即可；产孢子的丝状真菌发酵菌种一般采用干燥保藏法；
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不产孢子的丝状真菌发酵菌种须用液氮超低温保藏法；产芽孢细菌发酵菌种一般采用干燥保藏法；非芽孢细菌发酵菌种最好采用真空冷冻干燥法；放线菌一般采用干燥保藏法。
质量控制：①保藏样品制备前，应反复核对，监测生理生化指标，与亲本特征比较；②保藏样品制备后，仍要按需3%抽样检查，一旦有误，此批全部废掉；③注重菌种保藏的连续性。 4)菌种复壮
狭义的菌种复壮是指一旦发现菌种生产性状下降或杂菌污染，就必须设法采用分离纯化的方法恢复其原有的生物学性状。广义的菌种复壮是指菌种的生产性状尚未衰退以前，有意识地进行纯种分离和生产性状的测定，以期使菌种的生产性能逐步提高。狭义的菌种复壮是消极的，而广义的菌种复壮是积极的。
菌种退化的原因：基因突变和连续传代。自发突变率10—10，传种代数越多突变率越高。
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二、发酵菌种的扩大培养
1、概念
种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种的培养物称为种子。
接种龄：种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。以生长对数期且培养液中菌体量还未达到最高峰较为合适。
接种量：移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。大多数抗生素最适接种量为7%~15%。 种子罐级数：制备种子需要逐级扩大培养的次数。种子罐级数确定的依据：菌种生长特性、孢子发芽、菌体繁殖速度、发酵缺罐的体积。 2、发酵菌种扩大培养的目的、任务
菌种扩大培养的目的是为每次发酵罐的投料提供相当数量的、代谢旺盛的种子。 菌种大培养的任务是获得发酵活力高、接种量足够的微生物纯培养物。 3、种子的质量要求 （1）菌种细胞的活力强 （2）生理性状稳定
（3）菌种量能满足发酵罐的接种量 （4）无杂菌污染 （5）保持稳定的生产能力
4、获得优良发酵种子的条件：
①有一种能使保藏的菌种转移存活力达到最大的复活培养基上的方法；
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②有一个不引起种子染菌的接种场所； ③具有定判断种子质量标准的方法；
④具有定量测定菌种一系列生理状态变化的方法，能正确反映生物物质的连续变化； ⑤选择能满足种子扩大培养的容器和其他环境条件。 5、发酵菌种扩大培养的类型和方法 5.1发酵菌种培养的基本类型和方法 (1)静置培养和通气培养
根据菌种对氧的要求不同，有静置培养和通气培养。静置培养又称嫌气培养或厌氧养，指将发酵菌种接种于含有培养基的培养器中，进行不通气培养的方法，属于厌氧性生物的培养方法，如双歧杆菌发酵、乳酸发酵、丙酮一丁醇发酵的菌种培养。通气培养又称气培养或好氧培养，指将发酵菌种接种于含有培养基的培养器中，进行通气培养的方法，发酵工业中绝大多数发酵菌种的培养均采用此种培养方法。 (2)固体培养和液体培养
根据培养的性质不同，有固体培养和液体培养。固体培养又称曲法培养，是指将发酵种接种于固体培养基中进行培养的方法，如酿酒制醋中各种曲的培养、酱油酿造和食用菌产中的菌种培养。液体培养是指将发酵菌种接种于液体培养基中进行培养的方法，也是发工业中菌种培养的主要方法，如氨基酸发酵、有机酸发酵、核苷酸发酵、维生素发酵、酶剂生产、食品添加剂发酵、抗生素发酵、有机溶剂发酵等发酵中的菌种培养。 (3)浅层培养和深层培养
根据培养基的厚度，有浅层培养和深层培养。浅层培养又称表面培养，指在三角瓶、茄子瓶、克氏瓶、蘑菇瓶、瓷盘或曲盘(合)中进行液体或固体培养基浅层培养的方法，一般来说，实验室一级种子常采用浅层培养。深层培养是指在种子罐、发酵罐或曲池中进行液或固体培养基深层培养的方法，一般来说，生产现场的二、三级种子及发酵罐种子常采用层培养。
上述为发酵菌种培养的6种基本类型和方法，在此基础上，又有厌氧固体浅层培养、氧固体深层培养、厌氧液体浅层培养、厌氧液体深层培养、好氧固体浅层培养、好氧固体层培养、好氧液体浅层培养、好氧液体深层培养等多种培养类型和方法。 5.2 发酵菌种的常用培养方法
(1)好氧固体浅层培养(自然通风固体浅层培养)
好氧固体浅层培养也可称自然通风固体浅层培养，是发酵工业中制备种曲的方法。 1）固体培养最大的特点是固体曲的酶活力高，但需要较大的劳动强度。 2）其培养的设施设备有种曲室、曲盘或竹匾、种曲培养工具。
A、种曲室培养曲盘或竹匾固体种曲的场所称为种曲室，要求保温、保湿、防潮、密闭性好，而
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且便于清洗灭菌。一般开有门、窗、天窗各一个及排风扇，以利通风降温。墙壁是夹墙，中间填充保温材料或者利用厚建筑。房顶为圆弧形，向两边倾斜，防止冷凝水下滴而影响种曲质量。水泥地面，四周有排水沟和暖气片，用于保温。曲室的大小视制曲量而定，最好一批种曲设置一个种曲室，一般为长4m、宽3．5m、高3m。曲室内安放曲架，曲架为木质或铁制，其大小根据竹匾和曲盘的大小而定，一般高约2m，能放置6～8层竹匾或曲盘，每层高0.15～0.25m，最底层距地面0.5m。
种曲室每次使用前要冲洗，曲盘或竹匾用后洗净晒干，放人种曲室，同时将其他种曲工具全部投入种曲室内，密封门窗，采用硫黄(25g／m。)或甲醛(10mL／m。)进行熏蒸24h后，即达到杀菌目的。草帘或纱布须用水洗净后，采用高压蒸汽灭菌(121℃、20～30min)。接种拌料前，将手用肥皂洗净，再用75％酒精消毒。
B、曲盘或竹匾及种曲培养工具种曲培养是利用固体表面自然通风培养法，要求空气与固体培养基密切接触，以供霉菌繁殖和散热。所用设备为曲盘(木盘或铝盘)或竹匾，木精大小为O．45m×O．40m×O．05m，铝盘大小为0．85m×0．50m×0．04m，两端各有三个直径为3mm泄水小孔，竹匾的直径为0．90m左右。种曲培养的工具还包括蒸料锅、接种拌料台、振荡筛、木铲、草帘和纱布等。
（2）好氧固体深层培养(机械搅拌通风固体深层培养)
好氧固体深层培养也可称机械搅拌通风固体深层培养，是发酵工业中制备生产用曲的方法，目前比较完善的深层固体通风制曲，可以在曲房周围使用循环的冷却增湿的无菌空气来控制温湿度，并且能根据菌种在不同生理时期的需要进行调节，曲层的翻动也全盘自动化。
培养的设施设备有制曲室、机械搅拌通风制曲池。
A、制曲室大曲室与种曲室相比，其建筑构造与技术要求基本相同，只是大曲室比种曲室的面积要大，一般大曲室长10～12m、宽8m、高3m。大曲室的消毒灭菌与种曲室相同。
B、机械搅拌通风制曲池机械搅拌通风制曲池(如图2—28所示)，设在制曲室内，由池体、通风装置(空调箱或风机)、搅拌装置(翻曲机)三部分构成。池体一般用砖砌成，上抹水泥，呈长方形，上方敞开，长8～lOm，宽2m，高lm。池壁距池底0.2m处还有O.1m的宽边，上铺筛板，下置假底，假底为通风道，底部向上倾斜，倾斜度为8～10，以便通风均匀。池体两侧壁上设有齿轮导轨，供翻曲机移动，翻曲机依靠螺旋式叶片深入曲料中转动，并可前后左右移动，避免曲料结块，消除曲料中的裂缝，使曲料均匀疏松，利于通风。池体一端(倾斜较低的一端)设有通风口与风道相连，通风口配有空调箱和风机，空调箱用砖和水泥砌成，外装人孔、进风阀、回风阀、出风口等，内装有蒸汽加热喷嘴、进水管、溢水管、进水喷嘴等。空调箱的作用是把通人曲池风道的空气调节到一定的温、湿度，同时对空气进行净化，空调箱的进风口与风机相连，出风口与风道相连。风机一般选用离心式鼓风机，0．3m左右厚的曲料，宜选用130～140kPa的中压风机，风量(ma／h)为原料容积(m)的4～5倍，风速10～15m／s。通过曲料后的空气含有C02，且具有一定的温、湿度，可以利用。
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所以曲室内装有回风管，把通过曲料后的废气掺入新鲜空气中，这样调节了空气的温、湿度，而且还可以利用空气中的C02减少霉菌由于剧烈呼吸而引起的淀粉过度分解。但C02含量最高不超过10%，否则，致使霉菌窒息，故回风管要求安装阀门。
图2-1机械搅拌通风制曲池
(3) 载体培养
好氧固体浅层培养或深层培养，统称曲法培养，近年来，由曲法培养衍生出来的一种新方法称为载体培养，它是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物生长的载体，营养成分可以严格控制。发酵结束后，将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。据报道，利用该法培养霉菌、酵母菌、放线菌，可以提取色素、肌苷酸、酶等多种产物。作为载体应具有以下特征：
①具有多孔结构和足够的表面积，允许空气流通；
②能够耐蒸汽加热或药物灭菌；
③几何形状无特殊要求，形体大小应有适当范围； ④目前的载体材料以脲烷泡沫塑料应用得较多；
⑤吸水率(指载体体积与吸收的培养基体积之比)应保持较大的变化范围，便于灵活控制。
以泡沫塑料块为例，每立方米质量为1．5g，边长5～20mm，吸水率30%～90%。 (4)好氧液体浅层培养
1)好氧液体浅层培养的特点：菌种的生长繁殖速度受氧气供给的限制，而氧气的供给与培养基的深度有关；菌体培养时不需要搅拌通气，节省劳力。但该方法占地面积大，培养周期长，生产规模受到限制。
2）好氧液体浅层培养的主要设施与设备包括培养室、搪瓷盘、培养工具等。
柠檬酸发酵生产的早期曾采用好氧液体浅层培养，随着生产规模的扩大，柠檬酸发酵生产采用液体浅层培养很快被液体深层培养代替。
（5）好氧液体深层培养
1）好氧液体深层培养是发酵工业中应用最多、最广泛的方法，是指从种子罐或发酵罐底部送入无菌空气，再由搅拌桨叶将无菌空气分散成微小气泡溶解在液体培养基中，从而促进菌 体生长繁殖
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