和形成一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链，这两方面的原因}别解除了对PFK(磷酸果糖激酶)的代谢调节，促进了EMP途径的畅通。②由于丙酮酸羧化酶是组成型，不被调节控制，会源源不断地提供草酰乙酸。③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和C02固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，都增强了合成柠檬酸的能力。④由于顺乌头酸水合酶在催化时建立以下平衡： n(柠檬酸)：n(顺乌头酸)：n(异柠檬酸)=90：3：7
同时在控制Fe含量时，顺乌头酸水合酶活力低，使柠檬酸开始积累。⑤当柠檬酸浓度升高到某一水平，就会抑制异柠檬酸脱氢酶的活力，从而进一步促进柠檬酸的自身积累。柠檬酸的积累使pH值下降，到pH 2．0时，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累并排出体外。
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二、次级代谢调节机制
1、概念
次级代谢：微生物合成一些在微生物生长和繁殖中功能不明确的化合物，如抗生素、酶抑制剂、色素等的代谢。
次级代谢物：是指由微生物产生的，与微生物生长、繁殖无关的一类物质，但对生物生存有一定价值。如抗生素、毒枝菌素和色素。
前体：指加入到发酵培养基中的某些化合物能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。前体的作用：起抗生素建筑材料作用，诱导抗生素生物合成作用。（促进次级代谢物的的合成和形成特定的产物，实现定向代谢。）
中间体：指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，它们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。 2、微生物次级代谢的特性
（1）它的生产大多数是基于菌种的特异性来完成的。一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异的次级代谢物。
（2）次级代谢产物发酵经历两个阶段，即营养增殖期和生产期。如在菌体活跃增殖阶段几乎不产生抗生素。接种一定时间后细胞停止生长，进入到恒定期才开始活跃地合成抗生素，称为生产期。次级代谢产物在菌体分化期（生产期）才产生的可能原因：
1） 一种诱导因子在生长期末积累或从外源加入以解除生产期的阻遏作用。 2） 初级代谢的终点产物对次级代谢途径的反馈阻遏作用。
3） 在一种易被利用的糖源中生长，其分解代谢物对抗生素生物合成有阻遏作用。 4） 抗生素合成途径受高能化合物ATP的阻遏作用。
5）在生长期，RNA聚合酶只能启动生长期基因的转录作用，而不能附着在生产期操纵的促进子的位置上，致使次级生物合成的酶的生成受阻遏。
(3)一般都同时产生结构上相类似的多种副组分。一种微生物所合成的次级代谢物往往是一组结构相似的化合物。
(4)生产能力受微量金属离子(Fe、Fe、Zn、Mn、Co、Ni等)和磷酸盐等无机离子的影响。 (5)在多数情况下，增加前体是有效的。
(6)次级代谢酶的特异性不一定比初级代谢酶高，次级代谢酶的底物特异性在某种程度上说是比较广的。因此，如果供给与底物结构类似的物质，则可以得到与天然物不同的次级代谢产物。
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(7)培养温度过高或菌种移植次数过多，会使抗生素的生产能力下降，其原因可能是参与抗生素合成的菌种的质粒脱落之故。
（8）次级代谢在其一个系列当中与一个酶相对应的底物和产物也可以成为其他酶的底物。也就是说，在代谢过程中不一定非按每个阶段正确的顺序，一个生产物可由多种中间体和途径来取得，因此也可通过所谓“代谢纲目”或叫“代谢格子”这一系列途径来完成。 3、营养期(生长期)和分化期(生产期)的关系
（1）次级代谢的一个特征是次级代谢物通常是在生长阶段(营养期)之后的生产阶段(分化期)合成。
（2）次级代谢产物的形成出现较迟，这或许是抗生素产生菌避免自杀的主要机制之一。 （3）产物的形成是在某些养分从培养基中耗竭时开始的。
（4）易利用的糖、氨(NH3)或磷酸盐的消失导致次级代谢物阻遏作用的解除 4、微生物的次级代谢与初级代谢的关系 （1）菌体代谢方面
从图3-11代谢途径来看，次级代谢产物是以初级代谢产物为前体衍生出来的。
图3-11 从碳代谢流看初级代谢与次级代谢的联系
（2）遗传代谢方面
初级代谢与次级代谢同样都受到核内DNA的调节控制，而次级代谢产物还受到与初级代谢产物合成无关的遗传物质的控制，即受核内遗传物质(染色体遗传物质)和核外遗传物质（质粒）的控制。图3-12可看出，代谢产物的形成取决于由质粒产生的酶所控制的代谢途径，这类产物称为质粒产物。
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图3-12 次级代谢产物合成与初级代谢产物合成的关系
5、次级代谢调节 5.1 酶的诱导作用
如色氨酸在麦角生物碱合成中是一个前体，它对生物碱合成酶有诱导作用；在顶芽孢菌的头孢菌素C生物合成中，甲硫氨酸具有促进抗生素生产的作用。
微生物中的诱导酶只有在培养基中含有底物或底物类似物时才形成，后者并不攻击酶且是最好的诱导物。结构基因编码控制酶的产生，在没有酶底物存在时是没有活性的，即正常抑制酶产生，当加入一种底物时，结构基因就开动起来，酶即产生，这一过程称为“诱导”或“消除阻遏”，酶被“诱导”而大量生成。突变有助于消除酶形成依赖于添加的诱导物，这种突变称为调节基因突变，其位点不在结构基因而在调节基因上，如突变在调节基因上消除一种活性阻遏物，或突变在操纵基因上消除它与阻遏物结合的能力，那么就不需要添加诱导物，这种突变叫做“组成”型突变。 抗生素的合成是在微生物生长达到平衡后，由于特定营养成分减少而停止急剧生长，进入有限的生长期。此时，次级代谢才开始进行，在营养期一般不出现催化次级代谢的酶，所以可以认为在转换期发生了次级代谢酶的诱导或解阻遏。例如，色氨酸刺激麦角菌产生麦角灵(ergoline)生物碱。生物碱的合成在发酵后期出现，但必须在生长期加入色氨酸，才能刺激生物碱的生物合成。色氨酸类似物对生物碱的生物合成有同样的刺激作用，但它没有参与生物碱的合成。研究证实，色氨酸及其类似物诱导合成了生物碱合成的第一个酶——二甲基烯丙基色氨酸合成酶。
研究发现，有一种A因子(2(s)-异辛酰基-3R-羟甲基-r-丁酸内酯)强烈影响灰色链霉菌产生链霉素。lmg A因子加入A因子缺失的菌株的培养基中，可使它产生50000mg链霉素。在突变株中，当加入A因子后，即可测定出催化链霉素合成的转氨酶，且只有在接种后立即或不久加入A因子才能表现出促进链霉素产生的效果。A因子诱导链霉素合成的机制目前尚不清楚，可能与碳代谢有关。A因子还可控制灰色链霉菌的形态分化。
蛋氨酸刺激顶头孢霉生物合成头孢菌素C，蛋氨酸必须在生长期加人培养基中才能发挥作用。当顶头孢霉经突变得到蛋氨酸类似物硒代谢蛋氨酸抗性突变株，在不诱加蛋氨酸时可使头孢菌素C增产，亮氨酸为蛋氨酸的非硫类似物，也是一种诱导剂。
此外，类似诱导的例子还有展开青霉素(Patulin)生物合成途径中的一些酶是由中间体(如6-甲
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基水杨酸和m一羟基苄乙醇)协同诱导的。5,5-二乙基巴比妥盐(巴比妥)对利福霉素和葱环类抗生素(galirubin)生物合成的刺激作用，也可能是诱导现象。 5.2分解代谢产物的调节控制
分解代谢产物的调节包括分解产物阻遏和分解产物抑制。人们发现，葡萄糖的迅速分解和利用减少了许多抗生素的生物合成，这种现象最早发现于青霉素发酵受葡萄糖抑制实验，故称为“葡萄糖效应”。以后的研究证实了这种效应不是葡萄糖本身的作用，而是它的分解产物作用所致，因此称为“分解产物调节”，见表3—1。在含有葡萄糖和第二种碳源的培养基中，葡萄糖首先被利用，抑制抗生素的生物合成。只有在葡萄糖耗尽时，利用第二种碳源所需的酶才开始形成，并解除对抗生素生物合成的抑制。葡萄糖对青霉素和头孢菌素生物合成的阻遏作用，是由于葡萄糖分解产物阻遏ACV三肽(α-AA-Cys-Val: α-氨基已二酸、半胱氨酸和缬氨酸)合成酶的合成。当然，不排除对其他青霉素合成酶的阻遏。胞内效应物调节葡萄糖效应看来是葡萄糖的一种磷酸化衍生物。头孢菌素的生物合成明显受葡萄糖阻遏，使青霉素N不能转化为头孢菌素C。葡萄糖也阻遏青霉素环化酶，使它不能把ACV三肽转化为青霉素C。
在放线菌素合成中，氧化吩嗯嗪酮合成酶催化两分子3-羟基-4-甲基邻氨基苯甲酸或其肽衍生物的氧化缩合。当采用含有0.1%葡萄糖和1%半乳糖的谷氨酸无机盐培养基时，在20～24h内葡萄糖已被利用90％，形成75％菌体，30h后葡萄糖耗尽，培养物进入静止期。开始20h内几乎不合成氧化吩嗯嗪酮合成酶，在20～36h，该酶活力增加5～6倍，至40h则为12倍。放线菌素的合成比酶合成稍晚，在24h后才能被检出，在葡萄糖耗尽后才开始缓慢利用半乳糖。在半乳糖培养基中加入葡萄糖、甘露糖、甘油，将明显抑制酶合成。
解除分解产物阻遏的方法是：一方面选育对葡萄糖类似物抗性突变型来解除容易利用的碳分解调节，以提高抗生素产量；另一方面在培养过程中逃避分解产物阻遏。如使用利用缓慢的碳源，连续流加葡萄糖，保持低浓度葡萄糖，避开它对有关生物合成酶的阻遏；或使用能慢慢向培养基内渗出营养物质的颗粒(锭剂)。 5.3磷酸盐的调节
磷酸盐对抗生素生产的影响早已为人们所知晓。高浓度磷酸盐对许多抗生素，如链霉素、新霉素、金霉素、四环素、土霉素、万古霉素、新生霉素、紫霉素、杀假丝菌素等的合成具有阻遏和抑制作用。这些抗生素的合成只有在磷酸盐含量为生长的“亚适量”时才能合成。在高浓度磷酸盐中只长菌体，不合成抗生素；但磷酸盐太少时，菌体生长不够，也不利于合成抗生素。因此，发酵工艺上要严格控制“亚适量”的磷酸盐浓度。
磷酸盐抑制抗生素合成的机制可能有以下两方面：
(1)抑制或阻遏抗生素生物合成途径中有关酶的活力和合成。例如，金色链霉菌合成四环素时，磷酸盐阻遏脱水四环素氧化酶和环化氧化酶；在链霉素合成中抑制链霉素磷酸酯酶；在万古霉素合成中抑制碱性磷酸酯酶活性；阻遏泰乐菌素的dTDP-葡萄糖-4，6脱氢酶、dTDP my-Carose合成酶和macrocin甲基酶。这些关键酶被抑制或阻遏，都将引起抗生素生物合成大幅度减产。同样，过量磷酸盐抑制链霉素产生菌、比基尼链霉菌合成中间体链霉胍所需的转脒基酶活性的80%，会大幅度降低链霉素产量。
(2)改变代谢途径。过量磷酸盐能促使葡萄糖代谢由HMP途径转变为EMP途径，使一些抗生素的芳香族前体合成减少。例如，过量磷酸盐抑制四环素的生物合成是由于戊糖循环减少，而通过糖酵解途径进行。
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抗生素 作用酶 青霉素 头孢菌素 链霉素 太乐霉素 新霉素 巴龙霉素 卡那霉素 新生霉素 嘌呤霉素 放线菌素 杆菌肽 紫苏霉素 氯霉素 头霉素 丝裂霉素 表3—1 抗生素合成酶的碳分解调节 阻遏物 非阻遏物 产生菌 Penicillium chrysogernum Cephalosporium acremonium Cephalosporium acremonium 灰色链霉菌 弗氏链霉菌 弗氏链霉菌 白黑链霉菌 卡那霉素链霉1 雪白链霉菌 白黑链霉菌 抗生链霉菌 小小链霉菌 地衣芽孢杆菌 Micromonospoen inycensis 委内瑞拉链霉菌 三肽合成酶 葡萄糖 乳糖 CPC乙酰水解酶 葡萄糖、麦芽糖、蔗糖 甘油、琥珀酸盐 CPC合成酶、青霉素环葡萄糖 蔗糖 化酶 甘露糖链霉素合成酶、葡萄糖、糊精、甘露糖 脒基转移酶、链霉胍激 酶 胸苷二磷酸葡萄糖氧葡萄糖 麦芽糖 化还原酶、胸苷二磷酸 4-酮-脱氧葡萄糖甲基 酶 新霉素磷酸酶 葡萄糖 麦芽糖 O-甲基巴龙霉素甲基葡萄糖 甘油 转移酶 N-酰基卡那霉素胺基葡萄糖、麦芽糖、甘露 半乳糖 水解酶 糖 柠檬酸 葡萄糖 O-去甲基嘌呤霉素合葡萄糖 甘油 成酶 氧化吩嗯嗪酮合成酶 葡萄糖、甘油 果糖 犬尿素甲酰胺酶、 葡萄糖、甘油 果糖 色氨酸吡咯酶 羟基犬尿素酶 短杆菌肽S合成酶 葡萄糖 柠檬酸 杆菌肽合成酶 葡萄糖 麦芽糖 葡萄糖 甘油 口一半乳糖苷酶 甘油 淀粉、天冬素 葡萄糖 低浓度葡萄糖 +
5.4 NH4的抑制作用
在抗生素发酵中，若供给高浓度的无机氨态氮或其他容易被迅速利用的氮源，它们会促进生长，而强烈地抑制抗生素的合成。例如，黄豆粉用作放线菌发酵的氮源，消除了氨和氨基酸对抗生素生物合成的氮分解阻遏，这可能是黄豆粉的颗粒被放线菌的蛋白酶逐渐分解的缘故。在链霉素发酵中，氨是很差的氮源，而黄豆粉是最理想的氮源。而在红霉素发酵中加入某种氮源，产量会大为降低。带小棒链霉菌生产头霉素和雪白链霉菌生产新生霉素时,在抗生素生成期流加氮源，会促使细胞生长而抗生素生成量大为降低。受氮分解调节抗生素生物合成的还有多种抗生素，如氯霉素、头孢菌素、青霉素、棒曲霉素、利福霉素等。 5.5 初级代谢调节对次级代谢的作用
从图3-11可知，许多次级代谢产物来自初级代谢的关键中间体，因此次级代谢也受到初级代谢调节的影响。
在青霉素的生物合成中，初级代谢调节控制对青霉素生成有很大影响。由图3-12可知，青霉素由a—AA(a一氨基己二酸)、L一半胱氨酸和L一缬氨酸合成。合成青霉素的缬氨酸是D型，D型是在形成ACV三肽时形成的，而不是在形成噻唑环时形成的，因此真正的前体是L-缬氨酸。L-缬氨酸的生物合成见图3—13。L-缬氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶，影响青霉素的合成。通过选育乙酰羟酸合成酶对L一缬氨酸的反馈抑制作用敏感性低或不敏感的变异株，这样在菌体内积累较多的内源
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