的培养方法。其特点是，能够按照菌种的代谢特性以及不同生理时期的通气、 搅拌、温度、pH等要求，选择最佳培养条件。目前几乎所有好气性发酵都采取液体深层培养法，发酵罐的容积达到500～1000t，温度、pH值、溶解氧等均采用自动仪器或微机控制。
2）好氧液体深层通气培养包括三个基本控制点。第一，培养基的灭菌和冷却。发酵罐设置夹套(小型发酵罐或种子罐)或安装立式热交换器(大型发酵罐)，以便对培养基进行蒸汽 加热灭菌或冷却水冷却；或者将培养基通过连续加热灭菌冷却装置，再输送至灭菌的发酵罐中。第二，发酵温度的控制。采用冷却水循环流入发酵罐夹套或立式热交换器中，对发酵微生物生长繁殖和发酵产生的生物热进行冷却，维持恒定的发酵温度。第三，通气搅拌的控制。空气经过过滤器除菌后，由发酵罐底部进入发酵罐，再通过搅拌器将无菌空气打碎成微小的气泡，以延长气液接触的时间，加速和提高溶氧，并有利于传质和传热。
3）根据工艺控制不同，好氧液体深层通气培养又衍生出多种方法，包括放大法液体深层培养、两步法液体深层培养、控制法液体深层培养、分批法液体深层培养、分批补料法液体深层培养、连续法液体深层培养等。
4）好氧液体深层培养的主要设施与设备包括培养室和种子罐。种子罐与发酵罐形状及结构类似，可看成是小型发酵罐。
6、发酵菌种扩大培养的接种技术 6.1从实验室发酵罐接种至种子罐
图2-2从实验室发酵罐接种至种子罐示意
如图2—2所示，连接器A被一个内螺纹a栓盖住，在接种前栓a拧松，E阀关闭，F阀打开，使蒸汽从连接器A处排出。然后关F阀，开E阀，除去a栓并浸泡于强消毒剂中，则有无菌空气从容器中排出。再从连接器B上除去b栓，将连接器A与连接器B连接，关闭E阀，将压缩空气管与连接器C连接，使实验室发酵罐内的压力大于生产发酵罐。打开E阀，一级种子则被压人种子罐。最后，关闭E阀，脱开连接器A和B，移走一级种子罐，在连接器A处拧紧栓a，打开下阀，引入蒸汽。
6.2从生产种子罐接种至生产发酵罐
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如图2—3所示，将种子罐与生产发酵罐用柔性管道A-B连接。同时打开D、I、A、B、H、E、F阀门，关闭C阀，通过J、G阀门进入蒸汽灭菌20min，关闭J、G、I、H阀门，停止蒸汽灭菌。而F、E、D阀门仍处于打开状态，使连接管道内充满已灭菌的培养基。在生产发酵罐中通过分布管道如灭菌空气冷却发酵培养基至适当温度。将种子罐与无菌压缩空气管连接，使种子罐的压力提高到68.9kPa，而使生产发酵罐的压力降为13.8kPa，打开阀门C，种子液则由种子罐压人生产发酵罐。接种后将连接管道灭菌即可。
汽水分离器 汽水分离器
图2-3 从生产种子罐接种至生产发酵罐示意
7、菌种扩大培养流程、级数及其技术控制 7.1一般工艺流程与级数
发酵菌种扩大培养过程可分为实验室和生产车间两个阶段。其一般工艺流程如下:
实验室阶段菌种的扩大培养： 原种活化 ↓
试管固体或液体培养 ↓
三角瓶液体振荡培养(或茄子瓶斜面培养或三角瓶固体浅层培养) 一级种子 ↓
生产车间菌种的扩大培养： 种子罐培养 二级种子 ↓
扩大的种子罐培养 三级种子
对于不同产品的发酵而言，应根据菌种生长繁殖速度的快慢决定菌种扩大培养的级数。以细菌
为发酵菌种的发酵生产，如谷氨酸及某些氨基酸发酵，由于细菌的生长繁殖速度快，一般采用二级扩大培养的种子进行发酵；以放线菌为发酵菌种的发酵生产，如抗生素发酵，由于放线菌的生长繁殖速度慢，一般采用三级扩大培养的种子进行发酵，有些采用四级扩大培养的种子进行发酵，如链霉菌；以霉菌和酵母菌为发酵菌种的发酵生产，大都采用三级扩大培养的种子进行发酵，有的采用四级扩大培养的种子进行发酵。
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7.2发酵菌种扩大培养的技术控制
发酵菌种扩大培养的关键在于搞好种子罐的扩大培养，应在以下工艺技术方面加以控制。 (1)培养基的控制。一般来说，种子罐培养基较发酵罐培养基的碳氮比要小，有利于发酵菌种在种子罐中的生长繁殖；为了缩短种子在发酵罐中的生长繁殖的延迟期，种子罐和发酵罐的培养基应尽量一致；对于某一特定菌种和具体设备来说，培养基的最佳配比应进行；因素多水平的优化试验进行确定，才能最大限度地发挥菌种特性并提高产量。另外，培养基的组成不同，对不同发酵生产中的液体深层培养的真菌形态的形成也不同，如柠檬酸发酵需要菌丝球，而青霉素发酵真菌蛋白质生产需要丝状菌丝体。
(2)菌龄和接种量的控制。接种的种龄应选择对数生长末期，因为对数生长末期的种的单位体积数目最多，而且活力最强。种龄过嫩或过老，不但延长发酵周期，而且降低产量。接种量的大小直接影响发酵周期，通常抗生素发酵的最适接种量为0.7%～1.5%，有时可增加到2%～3%。适当加大接种量，可缩短菌体生长繁殖的延迟期，从而缩短发酵周期，提高设备利用率，同时减少杂菌污染的机会；但接种量过大，会造成菌种早衰、活力下降。另外，接种量大小对液体深层培养时真菌的形态具有一定影响：接种量较大，真菌形态呈弥散状的丝状菌丝体；接种量较小，真菌形态呈菌丝球。
(3)温度的控制。温度对微生物的影响主要表现为影响微生物体内的酶促反应，从而影响微生物的生产速率。同一微生物不同生长阶段对温度的反应也不同，延迟期对温度十分敏感，将细菌置于较低温度时，延迟期较长；将其置于最适温度时，延迟期缩短；孢子萌发在一定温度范围内(最低萌发温度一最适萌发温度)，随温度升高而缩短；处于对数生长期的细菌，如果在低于最适生长温度几度下培养，即使在培养过程中升温，升温的破坏作用也小；稳定生长期的细菌对温度不敏感，其生长速率主要取决于溶解氧。
为了使种子罐培养温度控制在一定范围内，生产上常在种子罐上安装热交换套、排管、蛇管进行温度调节。
(4)pH值的控制。培养基的氢离子浓度，对微生物的生命活动有显著影响。物都有自己生长与合成酶的最适pH值。同一菌种在不同pH条件下，其合成酶的的组成也不同，如黑曲霉发酵柠檬酸，在pH为2～3时，柠檬酸合成酶的活性最为柠檬酸；pH为7时，柠檬酸合成酶受到抑制，产物为草酸。培养基pH值在发能被菌体代谢所改变，阴离子(如醋酸根、磷酸根)被吸收或氮源被利用后产生NH3，则pH值上升；阳离子(如NH4+、K+、Na+)被吸收或有机酸的积累，则pH值下降。一般来说，高碳源培养基倾向于向酸性pH值转移，高氮源培养基倾向于向碱性pH值转移，这都跟碳氮比直接有关。
为了达到微生物充分繁殖和合成酶的目的，需要对培养基pH值进行调节。调节方法有三种：第一，使用酸碱溶液；第二，使用缓冲液(酸性条件下使用柠檬酸；中性条件下使用K2HP04 KH2P04；碱性条件下使用硼酸盐、甘氨酸；如果大量产酸，使用CaC03)；第三，使用生理缓冲盐。
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(5)通气和搅拌的控制 需氧菌或兼性需氧菌的生长与酶的合成，都需要氧气的供给。通气量与不同发酵菌种的生理特性以及同一菌种不同生理时期有关；还与培养基的黏度、种子罐或发酵罐的结构、通气管开孔的大小与多少、搅拌速度有关。为了达到最佳的通气效果必须通过试验去确定。
通气量取决于培养基中的溶解氧。只有氧溶解的速度大于菌体的吸氧量速率时，菌体才能正常地生长和酶合成；如果溶氧速率小于菌体的吸氧速率时，溶氧浓度降低，菌体生长和酶的合成就会减慢。
一般来说，培养基的黏度越小、种子罐或发酵罐越深、搅拌转速越大、通气管开孔越小且越多，空气气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度也越大。在培养基黏度、种子罐或发酵罐的结构、通气管开孔大小或多少一定时，搅拌对溶氧效果起决定性作用。搅拌可以提高通气效果，保证氧最大限度的溶解，以促进微生物的生长和酶的合成；而且搅拌有利于热交换，使培养温度趋于一致以及有利于营养物质和代谢物质的分散。但是搅拌速度必须选择适当，搅拌速度过慢，溶氧速度和溶氧量不够；搅拌速度过快，微生物细胞易遭破坏，泡沫产生过多，酶易氧化，易染菌。
(6)泡沫的控制。发酵菌种在培养过程中由于菌体的生长和代谢、培养基中成分的变化以及通气和机械搅拌因素的影响，使培养基中某些分子(如蛋白质及其胶体物质)在气液表面排列形成坚固持久的泡沫层。泡沫的存在，影响菌体对氧的吸收和CO2的排除，不利于菌体正常的代谢活动，减少了培养基在培养罐中的容量，降低了设备的利用率，容易发生跑料和导致染菌。
种子培养过程中的消泡措施主要有使用化学消泡剂、机械消泡和改进培养基成分三个方面，但最常见的是使用化学消泡剂。发酵工业中常用的化学消泡剂有多种天然动植物油、石油化工生产的矿物油、表面活性剂以及新型化学消泡剂有机硅聚合物等。
(7)种子罐级数的控制 种子罐的级数减少，可简化操作工艺，减少种子罐污染的机会，减少消毒及值班工作量以及减少因种子罐生长异常而造成发酵的波动。菌体的特性、孢子瓶中孢子数、孢子发芽及菌丝繁殖速度、发酵罐种子培养液的最低接种量、种子罐和发酵罐的容积比等都影响种子罐的级数。
如果孢子瓶中的孢子数量较多，孢子在种子罐中发育较快，且对发酵罐的最低接种量小，可采用二级种子扩大培养流程；种子罐的级数可随产物的品种、生产规模、工艺条件的改进作适当的调整。例如，改进种子罐的培养条件、加速孢子的发育或改进孢子瓶的培养工艺，增加孢子的数量，均有可能使三级种子培养简化为二级种子培养。
(8)染菌的控制。种子的培养与发酵过程中，染菌的主要原因有菌种不纯、培养基灭菌不彻底、无菌操作不严、空气净化不好、设备管道阀门漏损、设备本身存在消毒灭菌的“死角”。
防止种子培养与发酵过程中的杂菌污染，必须及时找出染菌的原因，采用有效措施，杜绝染菌事故再次发生。如果菌种不纯，必须反复分离纯化，直至完全纯化为止；如果菌种发生杂菌污染，必须严格无菌操作，定期检查消毒效果，加强接种室的消毒管理工作；对于出现杂菌菌落和噬菌体
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感染的试管斜面菌种，应予以废弃；平时应经常分离试管菌种，以防菌种退化、变异和杂菌污染；严格掌握菌种扩大培养工艺条件，严格检验每一级种子质量。必要时可将种子罐冷却，取样做纯种试验，确认无杂菌后，方可向发酵罐接种。 8、种子质量的判断 （1）pH
（2）培养基灭菌后磷、糖和氨基氮的含量 （3）菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
（4）其它参数：如接种前抗生素含量、某种酶活力等
思考题
1、发酵工业对菌种的要求是什么？ 2、什么是种子的扩大培养？
3、种子扩大培养的一般步骤与技术控制要点是什么？
4、什么是接种量？对于细菌、放线菌及霉菌常用的接种量是多少？ 5、发酵工业对种子质量有何要求？ 6、发酵菌种常用的培养方法有哪些？
第3章 微生物的代谢调控
教研室：生物工程 教师姓名： 余有贵
课程名称 授课内容 发酵工艺学 微生物的代谢调控 授课专业及班次 09级食品科学与工程方向 授课方式及学时 讲授、6H 24