生物指示剂计数的稳定性和耐热参数（DT值）测试应在其有效期内进行。应根据灭菌程序期望的杀灭要求（desired lethality）及所采用的验证程序来决定生物指示剂的实际数量和耐热性（见第5节）。
生物指示剂挑战系统的D值不仅与所用的种类或菌株相关，而且与测试的环境因素有关，这些影响因素包括但不局限于以下方面：
? 测试系统（如孢子是悬浮在液体中，还是经干燥附着在坚硬载体上？在加热过程中，
孢子周围有什么样的环境和特性？） ? 孢子悬浮所处的介质 ? 测试温度 ? 内包装材料
? 加热和冷却滞后没作校正对灭菌时间的影响 ? 加热和培养计数之间的温度、时间和环境条件 ? 用来培养计数灭菌后孢子的培养基 ? 培养条件
生物指示剂系统的测试操作，包括设备控制和技术人员的变动，都可以导致D值偏大或偏小的结果。
在验证试验中，应对实际条件下生物指示剂的耐热性进行评估，这点十分重要。因为生物指示剂所处的溶液或载体对生物指示剂的耐热性有影响。例如，在氯化钠或氯化钾存在的情况下，G..嗜热脂肪杆菌的耐热性会增强；在二价钙离子和镁离子存在的情况下，B.凝结芽孢杆菌的耐热性也会增强；在钾离子存在的情况下，C.梭状芽孢梭菌的耐热性会增强。（25）鳌合剂的存在（如柠檬酸）也会影响耐热性。强鳌合剂可以竞争性作用周围的离子，使包衣式芽孢的耐热性产生变化。（26）在接种的载体上（例如纸或橡胶），也可观察到相似的耐热性差异。
直接接种至基质/载体时，要确保生物指示剂保留在预定的接种区域以内并且在接种过程中不受损失。多次小量接种比一次性大量接种好控制，后者不小心会出现漂移。
药典（如美国药典、欧洲药典）有生物指示剂的专论来规定其标准，可用这些专论对湿热灭菌进行评估。在美国，不要求在工业灭菌步骤中采用药典收载的生物指示剂。在其他国家和地区，建议考虑当地的法规的监管要求。原文：compendia (e.g. USP, Ph Eur) contain
monographs defining BIs that may be used in evaluating moist heat sterilization. In the U.S., it is not a requirement to use a compendial BI for industrial sterilization processes. In other regions and countries it is recommended that consideration is given to local regulatory expectations.
3.2.2 化学监测器
化学监测系统是对一个或多个关键灭菌参数有响应的装置。它们可作为定性指示剂，证明一个产品已灭过菌了。如对化学指示剂的反应作了定量化处理，它们还可用来回答更为复杂的问题。不管它们的设计形式如何，在湿热灭菌程序的验证中，化学监测系统不能代替生物指示剂和温度/压力/时间的物理测试。
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3.2.2.1 化学指示剂
化学指示剂是以非定量形式反映灭菌程序参数的装置。化学指示剂能以持久不变标识（如颜色变化）的形式提供即时的结果，用来表示装载或产品已灭过菌。
化学指示剂不能表示产品是否无菌。它们只能说明曾达到某个温度限度，但不能指示最高温度及其持续时间。在装载中放置足够的化学指示剂，能避免已灭菌品和未灭菌品之间产生混淆，这一点是至关重要的。有多种形式的化学指示剂可供选择，如胶带、纸条或小安瓿等。
3.2.2.2化学综合指示剂（Chemical integritors）13
化学综合指示剂即是多参数的化学指示剂，它可以定量综合地指示湿热灭菌程序中的参数—通常是温度、时间，有时候也可以是湿度。它们可以定量地反映关键灭菌程序的物理状态，提供与微生物灭活相关的有量化结果的记录。
应用多参数的化学指示剂时，应清楚地了解它们的优缺点：
? 能同步监测湿度的化学综合指示剂可以获得被监控程序中灭菌条件的补充性信息，
但它不太适用于常见的温度和压力监控式的灭菌器； ? 可以指示灭菌程序验证中整个装载达到的热分布状况； ? 不能独立地用于灭菌程序的确认（cycle qualification）。
3.3热力学和蒸汽质量
了解热力学（thermo-dynamics）基础对湿热灭菌的设计和控制是很有必要的。在一定温度下，不同加热介质的内能有很大差别。过热水、饱和蒸汽、蒸汽/空气混合物含有的热能是不同的。在日常生产的灭菌程序中，必须达到在灭菌程序设计中确定的饱和蒸汽温度和压力之间的严格关系，以保证灭菌的效果。以下将阐述灭菌程序具体参数的重要性。
3.3.1 温度和热量
温度是热能的度量。热量是物体及其周围环境之间因温差而发生能量转移的结果。
应当理解，在同一温度下，不同加热介质（如饱和蒸汽、空气、蒸汽混合物或过热水）所含的热能差异极大。
蒸发/冷凝是饱和蒸汽灭菌中热能传递给被灭菌品的主要的手段。1克100℃的饱和蒸汽含有2,675焦/克的能量。这是100℃的水所含能量（419焦耳/克）14和蒸发所需热能（2,256焦耳/克）或蒸汽冷凝释放热量之和。在100℃时，1克蒸汽冷凝时，可将2,256焦耳的热量传递给物体。
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译注：如Fo试纸，它能在一定湿度条件下，对温度、时间有响应且有粗略地累计灭菌率L的功能。 译注：1cal=4.1868J（焦耳）
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图3.3.1-1所示水的加热曲线，可证明这个现象。（27）在25℃和一个标准大气压下，1克液态水的温度改变1℃时，需要4.1焦耳的热量。随着能量吸收，水的温度将升高，直至到达100℃。在100℃及一个标准大气压下，温度保持不变，直到水再吸收2,256焦耳能量而全部变为蒸汽。在过程倒过来运行时，即蒸汽冷凝成水时，能量会传递给物体。以下简图描述了由水变为蒸汽的物态变化的热力学，图没按刻度准确地绘制。
图3.3.1-1 一个标准大气压下水的加热曲线（27）
温度℃140120水100806040200-20419焦耳/g2,675焦耳/g水和蒸汽饱和蒸汽过热蒸汽Δ2,256焦耳以恒定速率增加的热量
在两个大气压下，当水的温度达到121℃时，再吸收2,199焦/克才会变为饱和蒸汽，如图3.3.1-2所示。
图3.3.1-2 2个大气压下水的加热曲线（27）
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温度℃160水140120100806040200-20水 50%水/蒸汽混合过热蒸汽饱和蒸汽干燥度=0潜热=0干燥度=0.5潜热=1,099干燥度=1.0潜热=2,199Δ2,199508焦耳/g2,707焦耳/g
在2个大气压的示例中（图3.3.1-2），当水和蒸汽处于“动态平衡”时，水和蒸汽之间的相变是2,199焦耳能量转移的结果。当水和蒸汽在特定压力和温度下处于平衡状态时，才会发生这个现象。
在简化的压力和温度状态曲线图中（图3.3.1-3），（28）红色曲线表示水和蒸汽的平衡状态。可根据此曲线上的点来计算并得到蒸汽表，然后将它与运行结果进行比较，以确定系统处于动态平衡，且蒸汽属―饱和‖状态。当蒸汽饱和时，曲线上一个特定温度下，只有一个对应的压力值。图3.3.1-3中标出了两个压力点：一个大气压下的温度约为100℃，两个大气压下温度约为121℃。
图3.3.1-3 温度和压力曲线图（三相点图）
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压 力 (大气压)3固相(冰)液相(水)2气相(蒸汽)1T温度100℃121℃
通过计算并将动态平衡下的对应的温度、压力列出，可得到饱和蒸汽表。一定温度和压力下水及饱和蒸汽所含的能量是确定的，因此，可以列入表中。表3.3.1-2为美国机械工程师学会（ASME）国际蒸汽表。（29） 表3.3.1-2 饱和蒸汽表
水及饱和蒸汽的性质（公制） 温度 ℃ 100 115 120 121 125 压力 巴** 1.013 1.692 1.987 2.026 2.322 压力 磅/英寸2 ** 14.71 24.99 29.84 36.45 41.87 焓（内能）焦耳/克 水 hL 419 483 504 508 525 △h* 2256 2216 2202 2199 2188 焓（内能）英热单位/磅 水 hL 180 208 218 228 238 △h* 970 952 945 938 931 蒸汽 hν 1150 1160 1164 1167 1170 蒸汽 hν 2675 2699 2706 2707 2713 水及饱和蒸汽的性质（美国常用单位） 温度 °F 212 240 250 260 270 *蒸汽冷凝或水汽化的潜热（△h= hν―hL） **1个大气压=1.013巴=14.71磅/英寸2
应检查任何饱和蒸汽灭菌程序的压力和温度，以保证数值与蒸汽表中基本一致。如果不一致，就可能表示灭菌过程中，饱和蒸汽冷凝的热效应没有完全发挥作用。此情况下，传递
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