血红蛋白(Hemoglobin)脱辅基和和重组
一、实验目的
1. 通过实验，了解结合蛋白的变性与变性条件下的行为，从而对结合蛋白中辅基的作用有更深的认识。
2. 学习一种生物无机生化科研中常用的为金属酶和蛋白质脱辅基和重组的方法。 3. 掌握柱层析法。 二、实验原理
血红蛋白是由二价铁Fe(Ⅱ)血红素作为辅基与多肽链结合组成的一种结合蛋白，它是由四个亚基组成的四聚体，分子量大约为65000Da。四个亚基中的两个亚基的氨基酸序列相同，称为α–亚基，每条链含141个氨基酸。另外两个氨基酸序列相同的亚基，称为β–亚基，各含146个氨基酸。α与β亚基有各自的二级、三级空间结构，亚基间以非共价键结合在一起。
每个亚基中均含有一个血红素辅基，它处于一个疏水环境，此疏水环境对血红蛋白的可逆载氧功能起着非常重要的作用。Fe(Ⅱ)在血红蛋白中始终是以+2价还原态存在的，若被氧化成Fe (Ⅲ)，则称为高铁血红蛋白（MHb），其失去可逆载氧的功能。 血红素与血红蛋白均以非共价键相连，其中包括: ① Fe(Ⅱ)与近端组氨酸(F8His)上的Nε上的配位键； ② 卟啉环侧链丙酸阴离子与蛋白质氨基酸侧链之间的盐桥； ③ 卟啉环中乙烯基与蛋白质的疏水相的相互作用。
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在酸性条件下，由于蛋白的变性而使这些作用变得很弱，以至于高铁血红素可以从血红蛋白的疏水区中游离出来。利用高铁血红素在丁酮中的溶解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性质，用多次丁酮萃取的方法将血红素与蛋白分离。分离得到的脱辅基血红蛋白(ApoHb)可以再用金属卟啉化合物(例如高铁血红素、钴卟啉、铜卟啉等)进行重组，生成各种不同金属卟啉的血红蛋白。
由于高铁血红蛋白（MHb）的紫外可见吸收光谱中，在405nm处有很强的特征吸收峰，而脱辅基血红蛋白(ApoHb)只在280nm处有蛋白的特征吸收峰，当将高铁血红素加入ApoHb溶液中后，重组成功的高铁血红蛋白（MHb）又会在405nm处出现它的特征吸收峰，因而血红蛋白的脱辅基与重组试验均可用紫外可见分光光度计进行检测。
三、实验器材及试剂。 四、操作方法
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1. 氧合血红蛋白的制备(略)
①氧合血红蛋白溶液的制备(略)： 取未溶兔血按实验书中的操作步骤提取得到了氧合血红蛋白溶液。 ②氧合血红蛋白溶液浓度的测定(略)：
具体为：取5?l Hb，加3.0ml H2O(稀释601倍)，用分光光度计作250nm～700nm的扫描，测得Hb的三个特征峰吸光值分别为：A415nm= 1.165548，A541nm= 0.131348，A576nm= 0.137625，已知这三个特征峰的吸光系数值为：·ε
（mmol·cm）、ε576 =14.6
415 =125
l/（mmol·cm）、ε541 =13.5 l/
l/（mmol·cm）。
由公式： 浓度C=(A×稀释倍数)/ ?，即可分别计算出三个浓度, 取其平均值即为制备的氧合血红蛋白Hb的浓度CHb =5.705（mmol/L）。 2. 氧合血红蛋白氧化成高铁血红蛋白 ① HbM的制备：
根据上述氧合血红蛋白的浓度(5.705 mmol/L)的用下式计算需加入过量1.3倍的K3Fe(CN)6 的量 (10mg/ml)(Mw=329.26) ：
V(mL)＝CHb?1?329.265.705?1?329.26?1.3??1.3?0.244(mL) 3310?1010?10取上述浓度(5.705mmol/L)的氧合血红蛋白1ml(VHb)， 置于 10 ml试管内（内置小搅拌子）放入冰浴烧杯内，用微量进样器（针筒）吸取K3Fe(CN)6 244μl，在缓慢搅拌下滴入鲜红色的HbO2溶液内，直到颜色变成棕黑色（MHb）的血红蛋白。
② 凝胶层析柱脱去多余的K3Fe(CN)6 。可先装柱子
本实验选用交联度高的小号胶：SephadexG-2，适于脱盐。通过层析
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柱脱去多余的K3Fe(CN)6 。将葡聚糖凝胶(Sephadex)装柱后，取50ml 10 mmol/L PBS平衡，调整流量: v = 1ml/min ,平衡20 min。将制成的MHb溶液全部上柱.。用4℃H2O洗脱（冰箱），收集棕黑色MHb，记录总体积V1（只收集最浓的4.8ml）移入小塑料离心管内，-20℃保存。
③ MHb特征吸收峰的扫描
取收集的MHb液0.1ml稀释至10ml (稀释100倍)作250～700nm的扫描，得MHb的紫外可见吸收光谱图，检测峰值A405。并用Excel输出全部数据。(第一次实验毕)。
三．脱辅基
以下步骤均在冰浴或4℃下进行：
a) 取3.5ml (从V1中) 高铁血红蛋白用1mol/L HCl粗调，再用0.1mol/L HCl细调溶液pH 3.0～3.5 (这一步是关键，pH太高，脱辅基不完全，pH过低蛋白会变性)，将溶液置于有盖的刻度离心管内。 b) 加入等体积予冷丁酮，手摇振荡萃取，静止分层，弃上层丁酮，取下层溶液，如此反复萃取3 - 4次，直至上层丁酮无色为止。 c) 取下层浅绿色ApoHb溶液装入透析袋，4℃对300mL 5 mmol/L NaHCO3分两次透析各15分钟，以除HCl。再对300mL蒸馏水(4℃)透析两次各15分钟，以除丁酮。 再对4℃ 200 ml 0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液透析两次各15分钟，中间取出透析袋倒置二次（此时会出现少量白色变性蛋白沉淀）。取出袋内溶液，用8000rp/min离心10
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min(4℃)，取上层清液，测体积V2 ，立即存于冰浴。
d) 取样稀释10倍，作250 ~ 700nm扫描，并检测A278nm蛋白吸收峰值(以0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液作参比 )。
计算脱辅基血红蛋白[ApoHb，其?278nm=13.1 L/（mmol·cm）]的浓度:
脱辅基的产率＝CApoHb?V2?100%
CHb?VHb4. 重组高铁血红蛋白
（1）取3.0mL（或实际量）ApoHb进行重组，按下式计算所需高铁血红素的体积(过量1.2倍)： 例如：若CApoHb=0.3, 则：
CV(mL)＝ApoHb?3?651.5?1.2?5?1030.3?3?651.5?1.2?0.1407(mL) 35?10（2） 缓慢搅拌下，用10～15min滴加所需体积的高铁血红素到3.0mLApoHb中，用1mol/L NaOH粗调和0.05mol/L NaOH细调溶液pH至9～10，溶液颜色变为棕红色。并在冰浴中再放置1 h。 （3）用Sephadex G-25装柱脱去过量的血红素，柱高20cm, 柱子用0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液平衡和洗脱，上样量取1ml, 用量筒收集重组后的高铁血红蛋白，测量总体积V3(乘以3倍)。
（4）取样稀释30倍后作250nm～700nm扫描，测重组后的峰值A405，最后计算重组率。列出扫描所得的各个紫外可见吸收光谱图。 五、结果计算及分析：
注意：所列数据均为范例，同学们实验完成后要换成自己的实验数据！
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