1. 氧合血红蛋白溶液浓度测定的计算： 浓度C=(A×稀释倍数)/ ?
① C415=( 1.165548 × 601)/ 125=5.604 ② C541= ③ C576=
C平均=（C415+C541+C576）/3=5.705(mmol/L) 2.MHb制备的计算：
需加入过量1.3倍的K3Fe(CN)6 的量 (10mg/ml)(Mw=329.26) ：
V(mL)＝CHb?1?329.265.705?1?329.26?1.3??1.3?0.244(mL) 3310?1010?103. 凝胶层析的结果记录及分光检测: V1=4.0mL ; AHb405组前(100倍稀释)= 0.5 4．脱辅基的结果记录及计算： ① V2=3.5； ② A278nm=0.4,
／L)＝则：CApoHb(mmolA278?稀释倍数0.4?10??0.3(mmol／L)
13.113.1③ 脱辅基的产率＝CApoHb?V20.3?3.5?100%??100%?18%
CHb?VHb4.982?15. 重组高铁血红蛋白的结果记录及计算： ① 所需高铁血红素的量的计算(过量1.2倍)：
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例如：若CApoHb=0.3, 则：
CV(mL)＝ApoHb?1?651.5?1.2?5?1030.3?1?651.5?1.2??0.0469(mL) 35?10② 凝胶层析的结果记录: V3(乘以3倍) = 4.5ml
③ 凝胶层析的结果记录及分光检测: AHb405组后(30倍稀释)= 0.3 ③ 重组率的计算：
例如：若重组前的峰值A405=0.5；重组后的峰值A405=0.3; V3=4.5mL, V1=4.0mL , V2=3.5, 则：
B＝脱辅基后所得ApoHb的总体积V23.5??1.167重组所用ApoHb的总体积3重组组率 重组后A405?重组组后稀释倍数?V3?B0.3?10?4.5?1.167100%?100%?23%重组前A405?重组组前稀倍数?V10.5?100?4.0列出扫描所得的各个紫外可见吸收光谱图, 对血红蛋白脱辅基前后及重组后的效果结果进行简单分析。 注意事项：
1. pH过低蛋白易变性，故调MHb时要迅速。 2. 丁酮萃取要快（3 - 4次即可）。
3. ApoHb在高温或剧烈摇动下易变性沉淀，脱辅基操作应在4℃下进行，
萃取时不宜剧烈振荡。
六、思考题：
1. 高铁血红蛋白脱辅基和重组时要求的pH条件是什么？试说
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明其原因。
2. 血红蛋白脱辅基后需分别对不同溶液进行透析，其作用是什么？
补充： 凝胶层析法
a. 原理
凝胶层析的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶是交联葡聚糖凝胶(Sephadex)。这种高分子材料具有一定孔径的网络结构，高度亲水，在水溶液里吸水显著膨胀。用每克干胶吸水量(mL)的10倍(G值)表示凝胶的交联度，可根据被分离物质分子的大小和工作目的，选择适合的凝胶型号。交联度高的小号胶 如SephadexG-25适于脱盐。本实验则用此型号脱盐柱脱去多余的K3Fe(CN)6 。
含K3Fe(CN)6的HbM溶液流经凝胶层析柱时，相对小分子质量的K3Fe(CN)6因进入凝胶颗粒的微孔中，所以向下移动的速度较慢；而大分子的HbM不能进入凝胶颗粒的微孔，以较快的速度流过凝胶柱，从而使HbM与K3Fe(CN)6分离。 b. 装柱
将层析柱垂直固定，加入1／2柱长的蒸馏水。把处理好的约30ml的凝胶用玻璃棒搅匀，然后边搅拌边倒入柱中(柱口保持排放)，最好一次连续装完所需的凝胶, 柱高约16cm。注意保持胶体无气泡和裂纹存在，并保持液面在凝胶床表面以上。 c. 平衡
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取50ml 10 mmol/L PBS平衡，调整流量: v = 1ml/min , 使胶床表面保持2 cm液层，平衡2 min。 d. 上样
将制成的HbM溶液全部上柱.。具体为：使胶床表面仅留约1 mm液层，吸取全部HbM，小心地注入层析柱胶床面中央。慢慢打开螺旋夹，待大部分样品进入胶床，床面仅有l mm液层时，用乳头滴管加入少量蒸馏水，使剩余样品进入胶床，然后用滴管小心加入2～4 cm高的蒸馏水。 e. 洗脱
用4℃H2O洗脱（冰箱），除去多余的亚铁氰化钾，收集棕黑色MHb，记录总体积V1，移入小塑料离心管内，-20℃保存。
f. HbM特征吸收峰的扫描
取收集的HbM液0.1ml稀释至10ml (稀释100倍)作250～700nm的扫描，得HbM的紫外可见吸收光谱图，检测峰值A405。并用Excel输出全部数据。
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