4.00 ml，混匀，室温5 min后，在610 nm波长下，用1.0 cm比色杯，以试剂空白调零，测定各管溶液的吸光度值A，记录数据，并绘制标准曲线。
2.2.3 尿钙样品测定
取A液、B液等体积混合，用EDTA溶液（16.7 g·L-1）调显色应用液空白吸光度值为0.41～0.45之间，收集的尿样根据需要稀释。
在试管中，加入尿样100.0 μl，再加入显色应用液4.00 ml，混匀，室温5 min后，在610 nm波长下，1.0 cm比色杯，以试剂空白调零，在与标准曲线相同的条件下测定样品吸光度值A，再由标准曲线计算出尿样含钙量。（当样品量较少时，也可用钙标准溶液100.0 μl替代尿样，用相同方法显色测定标准管吸光度值，利用“标准比较法”计算尿样含钙量）。
2.2.4 尿钙试纸的制备
A4液：称取8-羟基喹啉1.45 g，加2.4 ml 1：1盐酸，加20 ml水，搅拌促使其溶解；称取0.4560 g甲基百里香酚兰络合剂，加1.5 g聚乙烯吡咯烷酮（K30），加0.5 L水，搅拌促使其溶解；两液混合，定容至1 L，棕色瓶室温保存备用；
B液（缓冲溶液）：称取2.4 g无水亚硫酸钠，加0.2 L乙醇胺，加0.7 L水，微热，搅拌促使其溶解，定容至1 L，室温下保存备用；
在一平皿中，取A4液和B液各5.00 ml，用8 μl EDTA溶液（16.7 g·L-1）调节空白吸光度，完全浸泡定量滤纸一张，15 min后，取出平放于干燥洁净的平面玻璃上，室温下自然晾干。制成的试纸用洁净的塑料袋密封保存。
3 结果与讨论
本研究工作分为甲基麝香草酚兰分光光度法测定尿钙和尿钙试纸制备两部分。第一部分的目的是建立利用甲基麝香草酚兰分光光度法直接测定尿钙的方法，同时为尿钙试纸的制备确定理论依据，因为试纸是通过其颜色的变化对样品进行定性和半定量测定的，尿钙试纸色阶的变化与尿钙含量的关系及试纸浸渍液的浓度等，均需要用分光光度法确定，此外，尿钙试纸测定结果是否准确，也需要与分光光度法对比。
3.1 甲基麝香草酚兰分光光度法测定尿钙
3.1.1 实验条件的确定
根据相关文献[22]的报道，确定实验的测定波长为610 nm，测定温度为室温（20～30℃），A液的pH=2.5+0.2，B液的pH=12.3+0.2，显色应用液的pH=11.8+0.2。
3.1.2 显色应用液的调节
甲基麝香草酚兰法对Ca2+的灵敏度较高，试剂及实验用水中含有微量钙均有可能引入系统误差，导致标准曲线出现异常。因此，本实验用EDTA先将显色应用液中的微量钙加以掩蔽，通过调节试剂空白溶液的吸光度值及做标准曲线，找出其规律。
室温条件下，将A、B溶液各20.00 ml混合后，用EDTA（16.7 g/L）调节试剂空白溶液吸光度值，同时做标准曲线，在610 nm波长下，用1.0 cm比色杯，以蒸馏水调零，测定试剂空白溶液吸光度值，再以试剂空白调零，测定相应显色应用液所做标准系列的吸光度值，结果见表1和图1。
表1 试剂空白与标准曲线的关系
Tab.1 The relationship between reagent blank and the standard curve
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EDTA 试剂空白A0 试剂空白 标准曲线A（A0→0）
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加量/μl （水→0） 色阶 Ca2+/ mg·L-1 30.00 60.00 90.00 120.0 150.0 180.0
0 1.376 蓝 0.120 0.137 0.156 0.226 0.306 0.372
50 0.576 灰蓝 0.205 0.366 0.489 0.573 0.628 0.666
65 0.434 棕灰 0.133 0.279 0.403 0.512 0.593 75 0.412 棕灰 0.106 0.240 0.342 0.455 0.527 0.606
60 0.447 棕灰 0.137 0.260 0.391 0.485 0.555
80 0.395 棕灰 0.102 0.280 0.435 0.563 100 0.383 棕灰
结果表明，显色应用液加入EDTA可有效的调控试剂空白及标准曲线的优劣。当加入EDTA溶液（16.7 g·L-1）60～75 μl使试剂空白A0在0.41～0.45之间时，标准曲线为过原点的直线，线性范围较宽；当试剂空白A0大于0.45时，溶液中残留的Ca2+会使标准曲线的低含量点偏高，且线性范围较窄；反之，若EDTA过量，标准曲线低含量点偏低，均会造成测定误差，因此，实验确定调整显色应用液的试剂空白A0在0.41～0.45之间为宜。
0.70.60.50.4 A0=1.376 A0=0.576 A0=0.447 A0=0.434 A0=0.412 A0=0.395A0.30.20.10.00306090120150180
Ca2+/ mg·L-1
图1 试剂空白与标准曲线的关系
Fig.1 The relationship between reagent blank and the standard curve
3.1.3 甲基麝香草酚兰浓度对测定的影响
用分析天平准确称取甲基麝香草酚兰1.1400 g，按2.2.2方法配制A液，用A1表示；再改变甲基麝香草酚兰的量，分别称取甲基麝香草酚兰为1.1400 g的2，4，6，8，10倍，其它配制方法不变，按2.2.2配制不同浓度的A液，分别用A2，A4，A6，A8，A10表示。
取A1～A10液各20.00 ml，分别与B液20.00 ml混匀，用EDTA溶液（16.7 g/L）65 μl调各显色应用液的试剂空白吸光度值。在若干支试管中加入钙标准溶液（100.0 mg/L）50.00 μl，分别加入不同浓度的上述显色应用液各4.00 ml，振
荡混匀，室温5 min后，在610 nm波长下，用1.0 cm比色杯，以A1配的显色应用液的试剂空白调零，测定各管吸光度值A，结果见表2和图2。
结果表明，随着A液浓度的增大，显色反应的吸光度值逐渐增大，灵敏度逐渐增高，显色后溶液的颜色依次加深；当A液浓度为A1的6倍以上时，吸光度值不再变化。在此基础上，进一步考察甲基麝香草酚兰浓度对标准曲线的影响。
表2 甲基麝香草酚兰浓度的影响 Tab.2 Effect of MTB concentration
A液浓度 A1 A2 A4 A6 A8 A10 吸光度值 0.356 0.793 1.396 1.874 1.874 1.874
溶液颜色 浅兰 深兰 兰黑
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兰黑
棕黑 棕黑
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0.52.01.5
0.0A1A2A4A6A8A10A1.0A液浓度
图2 甲基麝香草酚兰浓度的影响 Fig.2 Effect of MTB concentration
取A1，A2，A4液各20.00 ml，分别与B液20.00 ml混匀，用EDTA溶液（16.7 g·L-1）调各试剂空白。
取若干支试管，分别加入钙标准溶液（浓度为0，30.00，60.00，90.00，120.0，150.0 mg·L-1）100.0 μl，再分别加入上述浓度不同的显色应用液各4.00 ml，振荡混匀，室温5 min后，在波长610 nm，1.0 cm比色杯，以各自试剂空白调零，测定各标准系列的吸光度值，结果见表3及图3。