3.1.7 实际样品分析及回收率
尿钙的采集处理及制做标准曲线见2.2.1和2.2.2。
取A、B液等体积混合，用EDTA溶液（16.7 g·L-1）调显色应用液的试剂空白吸光度值为0.41～0.45之间；尿钙根据需要稀释。
取若干支试管，“样品管”加尿样50.00 μl，水50.00 μl；“回收管”加尿样50.00 μl，分别加钙标准溶液（100.0 mg·L-1）10.00 μl及20.00 μl，均补水至100.0 μl；再加入显色应用液各4.00 ml，混匀，室温5 min后，在610 nm波长下，用1.0 cm比色杯，以试剂空白调零，测定各管吸光度值，由标准曲线查出相应含量乘以稀释数倍，计算出尿样含钙量及回收率，结果见表7。
尿样8次测定的相对标准偏差为0.5％，两个水平的加入回收率为104.9％～106.4％，精密度和准确度均好。
表7 实际样品回收率的测定（n=8） Tab.7 The recovery determination of samples
样品 钙测定值 样品加入量 测得总量 回收率 相对标准
（mg·L-1） （mg·L-1） （mg·L-1） （％） 偏差（％）
尿样 27.35 27.60 20.00 46.69 106.4 0.5 （稀释8倍） 27.35 27.85 40.00 65.33 104.9
27.09 27.35 27.35 27.35
原尿样含钙量 218.8
3.2 尿钙试纸的制备
实验根据甲基麝香草酚兰分光光度法测定尿钙的显色反应原理，探讨了尿钙
试纸的实验条件，对滤纸的选择、浸渍液最佳浓度、浸纸与干燥方式、稳定剂与衬色剂、试纸显色灵敏度与准确度及保存稳定性进行了研究。
3.2.1 纸质的比较与选择
选取定量、定性、普通三种滤纸，分别按2.2.4方法，加入适量的EDTA消除滤纸中钙的影响，制备成试纸，比较三种试纸测定钙标准溶液（100.0 mg/L）效果，结果见表8。
表8 纸质的比较与选择
Tab.8 The comparison and choice of paper
滤纸类型 浸泡溶液颜色 EDTA加入量/μl 调后颜色 浸泡时间/min 干燥后颜色 测钙结果 普通 深蓝 200 棕灰 15 不均匀灰白 纸条边沿显灰黄色
定性 蓝色 100 棕灰 15 不均匀淡兰 不均匀的蓝色
定量 灰色 10 棕灰 15 较均匀淡灰 较均匀的蓝色
结果表明，三种滤纸均含有不同量的钙，为消除滤纸中钙的影响，需用EDTA调浸渍液为棕灰色。在三种滤纸中，普通与定性滤纸含钙量高，干燥后的试纸颜色不均匀，测定钙时颜色也不均匀；定量滤纸含钙量较少，浸泡制成的试纸颜色较为均匀，测定钙时能够呈现均匀的蓝色。因此，选择定量滤纸用于试纸的制备。
3.2.2 甲基麝香草酚兰浓度对试纸测钙的影响
参照3.1.3实验结果，按2.2.4的方法，分别用A1，A2，A4液与B液等体积混合配成不同浓度的浸渍液，浸泡定量滤纸制成试纸，编号为1，2，3。用此三种试纸测蒸馏水、自来水、钙标准溶液（100.0 mg·L-1），比较其效果。结果见表9。
表9 甲基麝香草酚兰浓度对试纸测钙的影响
Tab.9 The impact of the concentration of MTB on paper measuring calcium
测定结果
试纸编号 试纸颜色 ———————————————————————————
蒸馏水 自来水 钙标液
1 淡灰白 淡灰 淡灰蓝 淡蓝 2 淡灰 淡灰 淡灰蓝 蓝 3 灰 棕灰 灰蓝 蓝
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由表9可知，三种试纸晾干后，颜色呈现不同程度的灰色，测蒸馏水、自来水和钙标准溶液（100.0 mg·L-1）时，试纸的分辨率随A液浓度的增大而增强。因此，综合考虑线性范围、分辨率、成本等因素，以A4液与B液等体积混合配成的浸渍液较好。
3.2.3 浸泡时间和次数对试纸测钙的影响
按2.2.4的方法，用相同浸渍液浸泡滤纸，浸泡时间分别为5，15，30，60 min后晾干，制成的试纸颜色均为棕灰色，测定不同浓度钙溶液时，色阶基本相同。
按2.2.4的方法，用相同浸渍液，浸泡两张滤纸15 min后干燥；将其中一张同法浸泡第二次晾干。用浸泡一次及二次的试纸测定含钙0，100，200，300 mg·L-1的溶液，二者的分辨率均好，无明显差别，只是浸泡二次的试纸同比颜色加深。
滤纸对浸渍液的吸附能力是试纸制备的关键因素。上述结果表明，按2.2.4方法浸纸一次、15 min即可；其原因可能是定量滤纸吸附能力较强，可在较短时间内吸附浸渍液达到饱和，再延长时间、增加浸泡次数，吸附量也不再增多。
3.2.4 衬色剂与稳定剂对试纸测钙的影响及试纸稳定性
按2.2.4的方法，用三份浸渍液浸泡滤纸，第一种直接用原溶液浸泡，第二种加入125 μl柠檬黄溶液（0.1 g·L-1）浸泡，第三种加入2 ml海藻酸钠溶液（5％）
浸泡，制成试纸，分别编号为1，2，3，用此三种试纸测蒸馏水、自来水、三种浓度钙标液，比较试纸分辨率的优劣，结果见表10。
表10 衬色剂与稳定剂对试纸测钙的影响
Tab.10 The impact of lining of color and stability on the paper measuring calcium
试纸编号 浸渍溶液 浸泡时间 干燥后颜色 测定结果
颜色 /min ————————————————————————————
蒸馏水 自来水 Ca2+/mg·L-1 100 200 300
1 棕灰 15 灰 灰白 淡蓝 淡蓝 蓝 深蓝
2 黄 15 淡黄 淡黄 淡蓝 淡蓝 蓝 深蓝
3 黄绿 15 灰 灰白 淡蓝 淡蓝 蓝 深蓝
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结果表明，三种试纸测蒸馏水、自来水和三种浓度钙标液，其色阶均可区分，但2号加柠檬黄衬色剂的试纸整体显色颜色较浅，分辨率不太好；3号加海藻酸钠的试纸颜色均匀；20 min后，加海藻酸钠的试纸色阶区分明显，而其它两种试纸基本已干燥。
将上述试纸放置一周后再次测定，测定结果见表11。
表11 试纸稳定性 Tab.11 The stability of paper
测定结果
试纸编号 ———————————————————————————————————
蒸馏水 自来水 Ca2+/mg·L-1 100 200 300
1 灰白 淡蓝 淡蓝 蓝
深蓝
2 淡黄 淡蓝 淡蓝 淡蓝
蓝
3 灰白 淡蓝 淡蓝 淡蓝
淡蓝
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由表10和表11可知，除1号试纸基本无变化外，其它两种试纸均有不同程度的变化，加海藻酸钠的试纸与加柠檬黄的试纸稳定性不好，放置一周后分辨率下降甚至失效；而1号原溶液浸渍液制备的试纸经实验观察至少可室温存放70天。
3.2.5 试纸干燥方式的比较
按3.2.4的方法加柠檬黄制备试纸，干燥方式分别为浸泡15 min后取出室温晾干和试纸在溶液中不取出让溶液自然挥发至干，分别测定蒸馏水和不同浓度的钙标准溶液，结果见表12。
表12 试纸干燥方式的比较 Tab.12 Comparison of paper dry ways
测定结果
干燥方式 干燥后颜色 ——————————————————————————————
蒸馏水 Ca2+/mg·L-1 100 200 300
晾干 灰黄 淡黄 淡蓝 蓝 蓝
挥发干燥 深灰黄 灰黄 灰蓝 蓝 深蓝
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表12说明，挥发至干的试纸比晾干的试纸显色灵敏度和分辨率均好，但其制备过程不利于大规模批量生产。