结果表明，A液浓度为A1的1～4倍时，标准曲线均较好，线性范围为0～120.0 mg·L-1，相关系数为0.9982～0.9985。这一结论不仅对甲基麝香草酚兰分光光度法测定尿钙有利，而且对于尿钙试纸的制备也有指导意义，因为一般情况下，由于吸附效率的影响，试纸浸渍液的浓度通常要比液相反应大，并且还要具有较大的线性范围及分辨率。因此，综合考
表3 甲基麝香草酚兰浓度对标准曲线的影响
Tab.3 The impact of MTB on standards
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吸光度值A A液浓度 _______________________________________________________________
Ca2+/mg·L-1 30.00 60.00 90.00 120.0 150.0 相关
系数 R
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A1 0.106 0.240 0.342 0.455 0.527 0.9985
A2 0.092 0.221 0.348 0.435 0.577 0.9983
A4 0.076 0.212 0.320 0.418 0.542 0.9982
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A10.6 A20.60.50.50.40.40.3A0.3A0.20.20.10.10.003060901201500.00306090120150
A40.60.50.40.3A0.20.10.00306090120150
Ca2+ / mg·L-1 Ca2+ / mg·L-1 Ca2+ / mg·L-1
图3 甲基麝香草酚兰浓度对标准曲线的影响
Fig.3 The impact of MTB on standards
虑显色灵敏度、线性范围及成本等因素，确定液相反应测定尿钙时，以A液原溶液即可，而尿钙试纸浸渍液的浓度，可选择A1～A4各浓度，视效果而定。
3.1.4 显色反应的稳定性
将A、B液等体积混合，用EDTA溶液（16.7 g·L-1）调好试剂空白吸光度值，混匀；在试管中加入钙标准溶液（100.0 mg·L-1）100.0 μl和显色应用液4.00 ml，立即混匀、记时，室温（20 ℃）条件下，在波长610 nm，用1.0 cm比色杯，以试剂空白调零，测定吸光度值随时间的变化，结果见表4和图4。
表4 显色反应稳定性 Tab.4 The stability of color reaction
时间/min 0 4 6 8 10 12 16 20 30 40 50
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A610nm 0.522 0.512 0.505 0.503 0.501 0.500 0.499 0.497 0.493 0.493 0.488
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0.60.50.4A0.30.20.10.001020304050
时间/min 图4 显色反应稳定性 Fig.4 The stability of color reaction
数据表明，显色反应初期吸光度值略偏高，在4～16 min吸光度值较高并且较稳定，随后到50 min内变化呈平缓状态，仅下降0.012，说明显色反应体系稳定性较好。实验选择最佳测定时间为5 min。 3.1.5 显色应用液的稳定性
将
A、B液等体积混合，用EDTA溶液（16.7 g/L）调好显色应用液的空白
吸光度值，测定试剂空白及线性，室温放置数天，每隔一周测定一次试剂空白及线性，结果见表5和图5。
表5数据和图５表明，显色应用液空白吸光度值随时间延长而增大，颜色逐渐加深并向紫色变化；标准系列吸光度值随时间延长有降低的趋势，线性数据存放两周后越来越差；色阶的颜色在一周后就开始向紫色变化；存放到第四周，线性已很不好；故显色应用液室温存放的保质期大约3周。但A、B液单独存放，室温可稳定一年[22]。
表5 显色应用液的稳定性
Tab.5 The stability of color application solution
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存放时间 标准系列吸光度A及色阶
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/周 Ca2+/mg·L-1 0 30.00 60.00 90.00 120.0 150.0
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0 棕灰
灰 灰蓝
蓝灰
浅蓝 蓝
0.455
浅蓝 蓝 0.364 0.439 淡蓝紫 浅紫灰
0.310 0.415
蓝 0.527 蓝 0.581 0.505
0.412 0.106 0.240 0.342 1 棕灰紫 浅蓝灰
0.907 0.124 0.258 2 棕灰紫 紫灰 灰紫 1.253 0.106 0.225 3 4
紫灰 紫灰 紫灰 紫灰 紫灰 紫灰 1.563 0.056 0.120
1.754 0.015 0.140
浅蓝 浅蓝 紫蓝 紫蓝
0.183 0.261 0.318 紫灰 紫灰 浅紫灰 0.186 0.215 0.256
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0d 7d 14d 21d 28d0.60.50.40.3A0.20.10.00306090120150
Ca2+/ mg·L-1
图5 显色应用液的稳定性
Fig.5 The stability of color application solution
3.1.6 标准曲线及方法学评价
将A、B液等体积混合，用EDTA溶液（16.7 g·L-1）调显色应用液的试剂空白吸光度值为0.41～0.45。
取若干支试管，分别加入不同浓度的钙标准溶液（0，30.00，60.00，90.00，120.0，150.0 mg·L-1）各100.0 μl，再加入显色应用液4.00 ml，振荡混匀，室温
5 min后，在610 nm波长下，用1.0 cm比色杯，以试剂空白调零，测定各管吸光度值，绘制标准曲线，结果见表6和图6。
表6 标准曲线 Tab.6 Standard curve
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Ca2+/mg·L-1 30.00 60.00 90.00 120.0 150.0 试剂空白A0
（水→0）
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吸光度值A 0.137 0.260 0.391 0.485 0.555 0.447
结果表明，钙含量在0～120.0 mg·L-1范围内符合朗伯-比尔定律，线性回归方程为A=0.0098+0.00408c，相关系数R=0.9982，线性关系良好。
0.60.50.4A0.30.20.10.00306090120150
Ca2+ / mg·L-1 图6 标准曲线 Fig.6 Standard curve