蓬莱市疾病预防控制中心
作 业 指 导 书
寄生虫检测作业指导书
文件编号：PLCDCW031014
版号：第2版 第2页共4页
1.2 碘液玻片法涂片 制法同1.1，仅用碘液代替生理盐水而制涂片。包囊呈棕色，未成熟包囊的糖原泡呈棕色，核与囊壁不着色而透明。 1.3 铁苏木素染色法
1.3.1 用新鲜粪便于载物玻片上制成薄膜。
1.3.2 立刻放入热至40℃邵氏固定液中，约3～5min.固定液温度低于40℃时需15～30min。
1.3.3 再放入70％酒精中5～10min，然后移至70％碘酒精脱汞10min以上，使涂片变为棕色。
1.3.4 放入70％酒精中1h或过夜，再放入50％酒精中5min。 1.3.5 用流水轻轻冲洗10min，再用蒸馏水冲洗。
1.3.6 放入热至40℃20g/L的铁明矾溶液中媒染2min或40g/L的铁明矾溶液中1～6h，自来水冲洗5min。
1.3.7 移入5g/L的苏木素染色液中1至数小时或过夜，自来水冲洗5min。
1.3.8 再放入20g/L的铁明矾溶液中20min，至颜色适当，细胞核清晰可见为止，再以流水冲洗5min。
1.3.9 依次放入50％、70％、80％、90％、95％、100％酒精中各2～10min。 1.3.10 放入二甲苯和纯酒精各半的溶液中及纯二甲苯中各约2min，以透明之。 1.3.11 用中性树胶封片、干燥、镜检。 1.4 染色结果
滋养体的核膜呈深蓝黑色，核仁与核膜之间清晰，核膜内染色质粒分明，细胞质蓝色，食物泡内含物为深蓝色。包囊为蓝色，核与滋养体清晰可见。红细胞呈红色，拟染色体呈深蓝黑色，糖原泡在染色过程中被溶解成空泡。 1.5 培养检查法
1.5.1 采取粪便标本，务求新鲜，所用器皿清洁干净。尿液或水勿混入粪便或容器内。
1.5.2 标本采集，应选择脓血及粘液部分；比较正常的粪便，要采取不同部位。成形或半成形便应采取5～10g，放入便盒。液质或半液质粪便，可用小勺装入试管或标本瓶中。任何
2009年08月10日发布 2009年08月14日实施
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容器均应加盖，容器外面切勿沾染粪便。
1.5.3 粪便采集后，应立即送检，务必在2h内进行检查。 1.5.4 培养方法（多栖培养法）
1.5.5 成形或半成形便，用灭菌的接种环取豌豆大小，接种于培养基的液体部分，并在管壁上轻轻研磨，使粪便混匀于液内。
1.5.6 液质或半液质粪便则用灭菌吸管，吸取0.5mL粪液，接种培养基的液体部分中。 1.5.7 放入37℃温箱，培养48h，用吸管取沉淀物一滴，作涂布检查。方法见1.1。
1.5.8 若检查结果为阴性，应从培养管底部吸取沉淀物0.5mL转种另一培养基中，再经48h培养后检查，仍为阴性，报告。
C 血吸虫检查（包括A的改良加藤厚涂片法） 1.1间接红细胞凝集试验（IH8）
1.1.1抗原：为用葡聚糖凝胶G100初步纯化的SE8致敏的绵羊红细胞。所用绵羊红细胞先经2.5%戊二醛化及1：5000鞣酸溶液鞣化后再行致敏。致敏后的红细胞以含10%蔗糖及1%正常兔血清的PH7.2P4S配5%悬液，分装安瓿低压冻干封存。每批致敏红细胞作效价测定，滴度达1：1280～1：2560为合格。抗原也可采用SE8和8U8的混合抗原；血球也可采用人“O”型红细胞。 1.1.2操作方法
1.1.2.1启开安瓿，每支以1ml蒸馏水稀释混匀备用。
1.1.2.2用微量滴管加4滴（0.025ml/滴）生理盐水于微量血凝反应板第一排第二孔内，第三孔空白，第四孔加1滴。
1.1.2.3第一孔内储存待检血清，并从中吸取血清1滴加入第二孔内，充分混匀后，吸出两滴于第三孔和第四孔各加1滴。在第四孔混匀后弃去1滴使第三孔、第四孔血清稀释度为1：5，1：10。
1.1.2.4用定量吸管吸取致敏红细胞悬液，于第三孔和第四孔内各加1滴，立即旋转震摇2min,室温下静置1h左右，观察结果。
1.1.2.5每次试验均应有阳性血清作阳性对照，生理盐水作阴性对照。
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1.1.3结果判断
1.1.1.1阴性反应为红细胞全部沉入孔底，肉眼见一边缘光滑，致密的小圆点。 1.1.3.2阳性反应：
＋＋＋＋ 红细胞形成薄层凝集，边缘呈现不规则的皱褶。 ＋＋＋ 红细胞形成薄层凝集，充满整个孔底。 ＋＋ 红细胞形成薄层凝集，面积较“＋＋＋”者小。
＋ 红细胞大部分沉集于孔底，形成一圆点，周围有少量凝集的红细胞，肉眼见周边模糊（或中间出现较为明显的空白点）。
1.1.4反应标准：以血清1：10稀释出现凝集反应可判为阳性。 1.2 酶联免疫吸附试验（ELIS8）
1.2.1抗原或抗体：常用SE8包被载体检测抗体，亦可用单克隆抗体包被载体以检测抗原。 1.2.2操作方法
1.2.2.1于微量聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板的凹孔中加入100μl以PH9.6碳酸盐缓冲液稀释的SE8或单克隆抗体，置4℃过夜。
1.2.2.2次日倾去抗原，用含有0.05%吐温－20的磷酸缓冲盐水（P4S-T PH7.4，0.01mol/L）洗涤3次，每次5 min。
1.2.2.3于凹孔中加入以P4S-T作1：100或 1：200稀释的受检者血清及参考血清（每批设1个阴性对照和1个阳性对照）100μl，37℃，1h。 1.2.2.4倾去血清，以P4S-T洗涤3次，每次5 min。
1.2.2.5加入以P4S-T作1：1000或 1：4000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）-标记结合物100μl，37℃，1h。
1.2.2.6倾去酶标记结合物，以P4S-T洗涤3次，每次5 min。
1.2.2.7加入100μl已加H2O2的邻苯二胺（OPD）或四甲基联苯胺（TM4）底物溶液，37℃，30min。
1.2.2.8在各凹孔中加入2mol/L硫酸（H2SO4）50μl以终止反应。
1.2.2.9在酶标专用比色计上读取492nm（OPD为底物）或450 nm（TM4为底物）光密度（OD）
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值，以P/N≥2.1倍判为阳性。 1.3胶体染料试纸条法试验（DDI8） 1.3.1抗原：胶体染料标记的血吸虫SE8。 1.3.2操作方法
1.3.2.1轻轻混匀抗原贮存管中胶体染料标记的抗原液。
1.3.2.2加50μl标记液至PVC小杯中，再入10μl待检血清，缓缓混匀1min。
1.3.2.3取试纸条插入小杯中，约10min左右，待对照带区出现紫蓝色反应带，即可判断结果。 1.3.3结果判断
以检测带区和对照带区均出现紫蓝色反应带为阳性；以对照带出现紫蓝色反应带，而检测带区无反应为阴性。
1.4环卵沉淀试验（COPT）
1.4.1虫卵：热处理超声干燥虫卵粉。以重感染兔血清（接种尾蚴1500～2000条，42 d的兔血清）测试环沉率＞30%为合格。
1.4.2操作方法：先用熔化的石蜡在洁净的载玻片两端分别划两条相距20mm的蜡线，在蜡线之间加受检者血清2滴（0.05 ml～0.10 ml），然后用针头挑取干卵约100个～150个，加入血清中，混匀，覆以24mm×24mm盖玻片，四周用石蜡密封后，置于37℃温箱中，经48h～72h后用低倍（80×～100×）显微镜观察反应结果，疑似者应在高倍（400×）显微镜下加以识别。
为简化操作亦可选用预制的有双圆孔的双面胶纸条，只需在圆孔中加入干卵和50μl血清，覆以盖玻片，置37℃孵箱中48h，观察结果。或选用预制干卵PVC膜片，只需加入血清，置湿盒中37℃保温经24h取出，倾去血清，加少量盐水显微镜下观察反应。
1.4.3反应标准：典型的阳性反应虫卵周围有泡状、指状或细长卷曲的带状沉淀物，边缘较整齐，有明显的折光。其中泡状沉淀物须大于10μm（约相当于两个红细胞大小），才能定为阳性。阳性反应的标本片，应观察100个成熟虫卵，计算其沉淀率；阴性者必须看完全片。 阴性反应：虫卵周围光滑，无沉淀物；或有小于10μm的泡状沉淀物。 阳性反应的强度和环沉率：
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“＋”虫卵周围出现泡状、指状沉淀物的面积小于虫卵面积的1/4；细长卷曲的带状沉淀物小于虫卵的长径。
“＋＋”虫卵周围出现泡状、指状沉淀物的面积大于虫卵面积的1/4；细长卷曲的带状沉淀物相当于或超过虫卵的长径。
“＋＋＋”虫卵周围出现泡状、指状沉淀物的面积大于虫卵面积的1/2；细长卷曲的带状沉淀物相当于或超过虫卵长径的2倍。
计算 环沉率（%）=阳性虫卵数/全片观察成熟虫卵数×100% 环沉率≥3%时，判为阳性。 1.5斑点金免疫渗滤试验（DIGF8） 1.5.1抗原：1%血吸虫SE8 1.5.2操作方法
45.2.1在小盒中央膜上加4液（PH8.2的0.02M TRIS-Hcl缓冲液）2滴（100μl），待渗入。 1.5.2.2加待检血清25μl，待渗入。 1.5.2.3加4液2滴（100μl），待渗入。
1.5.2.4加入8液（金标记SP8或抗人IgG结合物）2滴，待渗入。 1.5.2.5加4液2滴（100μl），待渗入。
1.5.3结果判断：在膜上显示红色斑点为阳性，仅留白色背景为阴性。色泽接近标准阳性者为＋，色泽与阳性血清一致者为＋＋，色泽深于标准阳性者为＋＋＋。 1.6粪便检查
1.6.1尼龙绢袋集卵孵化法
操作步骤：取受检者粪便约30g，先置于40目～60目/25.4mm的铜丝筛中，铜丝筛置于下口夹有铁夹的尼龙绢（260目/25.4mm）袋口上，淋水调浆，使粪液直接滤入尼龙绢袋中，然后移去铜丝筛，继续淋水冲洗袋内粪渣，并用竹筷在袋外轻轻刮动助滤，直到滤出液变清。取下夹于袋底下口的铁夹，将袋内沉渣淋入三角烧瓶。如需加做沉淀镜检，可在烧瓶中吸取沉渣3滴～4滴放在载玻片上，抹成涂片，涂面应占载玻片面积的2/3。涂片的厚度以能透过涂片尚能看清印刷字体为标准，将涂片置于低倍显微镜下检查。全片镜检时间不宜少于2min，
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