南方医科大学生物医学工程系 孙全明毕业论文
Sinofiler_试剂盒在广东汉族人群的法医学应用研究
目前，短串联重复序列（short tandem repeat，STR）是法医DNA分析中最常用的一类遗传标记。STR广泛分布于人类基因组中，重复单位长度为2-6bp，属微卫星序列，平均每6Kb～10Kb就有一个STR基因座，总数估计有20到40万个码区，极少数出现在编码区
【4,5】
【1，2,3】
。STR基因座绝大多数位于非编
【6】
，其中约有一半以上具有遗传多态性。因为STR基因座多
态性片段一般在400bp以下，故PCR扩增成功率高，检测灵敏度高，重复性好，适用于微量、陈旧、腐败检材以及接触DNA即脱落细胞的DNA分型鉴定。自1985年英国遗传学家Jeffreys在法庭上首次应用DNA指纹技术鉴定一宗移民纠纷案，同年Cetus公司Mullis等人发明聚合酶链式反应技术（PCR）以来
【7】
，经过二十多年的发展，各种新技术、新仪器不断出现，
检验的遗传标记不断地增加，提供的信息不断地增多，涉及的理论不断地深入完善，各种研究数据不断地丰富，我国各省地市的院校、公安司法部门的刑事科学技术研究所的DNA实验室如雨后春笋般大量地建立，使法医DNA应用得到了广泛地飞速地发展，DNA检验技术也得到了很大的提高，我国的刑事科学技术研究所应用该技术成功地鉴定了大量疑难案件的生物物证，在刑事案件的侦破、一些重大事故的尸源认定、民事案件的解决上发挥了重要作用。从1986年我国开始用银染法鉴定3个等位基因座（有代表性的是美国Promega公司研发的三套系统：CTT: CSFIPO 、 TPOX、TH01；FFv：F13A01、FESFPS、vWA；Silver Ⅲ:D16S539、D7S820、D13S317。），到用荧光复合扩增、毛细管电泳检测的Profiler Plus 试剂盒9个等位基因座到Identifiler试剂盒、Power Plus试剂盒的16个等位基因座；其累积匹配概率从10到Profiler Plus的10到Identifiler、Power Plus的10
-10
-18【7】
-9
；从个案的鉴定到法庭科学DNA数
据库的全国联网，在个体认定、亲缘鉴定方面逐步过渡到科学、高效、高度公信力的状况。
众所皆知的2009年7月5日发生在新疆乌鲁木齐市的7.5打砸抢烧严重暴力犯罪事件，导致197人死亡，1600多人受伤（官方报道），公安部物证鉴定中心对此特大事件的大量生物物证：死者、伤者、嫌疑人血样，血衣等的两千余份检材进行了检验。截止我写稿日期，2009年3月8日，最高人民法院审理97案判处了198人，此间DNA在罪犯和犯罪的认定方面发挥了重要的作用。
值得一提的是，2004年10月20日郑州煤业集团公司大平煤矿发生一起煤与瓦斯突出而引发的特别重大瓦斯爆炸事故。造成148名矿工遇难，32人受伤。当时我们用Identifiler试剂盒检验了腐败、不腐败的遇难人员血样、肌肉等114份，在尸源认定方面做了大量的工作，那时的数据库数据量还不是很大，我们获得了较为满意的结果。
随着人类基因组计划的完成，更多的STR基因座被发现，其中一些基因座能力更强，更适合法医学应用，发展新一代的试剂盒成为可能，也很有必要。为了适应中国国情，提供针对中国人群的较大识别力试剂，美国应用生物系统公司开发研制了AmpF.STR? Sinofiler. PCR试
- １ -
南方医科大学生物医学工程系 孙全明毕业论文 剂盒，除了含有Identifiler试剂盒D8S1179, D21S11,D7S820,CSF1PO, D3S1358, D13S317, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, D18S51, D5S818 和 FGA. 13个基因座外，特别将识别力低的TH01、TPOX基因座 替换成了D6S1043和D12S391。这两个基因座多态性更高(特别在中国汉族人群体)。为了使Sinofiler.试剂盒得到更好的应用，一些问题还需要进一步调查和研究。主要有以下几个方面:
1.群体多态性:多态性频率资料是准确计算个体识别力、非父排除率、多态信息含量等重要的法医学参数,是评估法医学应用效力的基础数据。任何遗传标记在应用于刑事鉴定或民事鉴定之前都必须对其进行准确的群体多态性调查研究。但我国有关不同人群STR基因座多态性频率资料样本量普遍较少，难以保证观察样本能够代表该群体的基因频率分布资料，人群之间的差异性比较也不多。本研究从分析了郑州市公安局收集的无关人血样，代表了广东广大居住地的随机人群。将检测分析结果作统计学分析，了解STR基因座的等位基因数、基因分布频率。证实调查结果是否符合遗传平衡定律(Hardy一Weinberg定律)，计算群体遗传学参数，如杂合度(H)，个人识别能力(PD)，多态性信息含量(PIC)等。而准确统计不同人群各个STR基因座的多态性信息是计算这些法医学应用参数的基础，调查样本量必须在200个以上。当案件有关生物物证的STR分型结果与嫌疑人一致时，必须计算似然率LR，用科学的参数向法庭表述。
2、将调查得到的15个STR基因座统计学资料与其他群体比较。
[3、9-16]
[8]
近年来，国内外
已有少量AmpF.STR? Sinofiler. PCR试剂盒基因座研究报告。通过群体比较，查找群体间的差异，为不明来源个体的个人识别和亲权鉴定提供理论根据，同时探讨人类进化和迁徙。
3、检出微变异体等位基因（microvariant）和稀有等位基因。通过对所测样本中检出分型标准物以外（off-ladder-allele）的等位基因的样品进行了单基因座扩增和测序，检出一些稀有等位基因。
4、与Identifiler系统在DNA数据库中的系统效能及个体效能进行了比较研究。Identifiler系统15个基因座的累积个体识别能力值(TDP)即个体识别的系统效能为0.999 999 999 999
?999 98（参考本实验室广东汉族Identifiler系统的频率调查资料）。本研究得到的Sinofiler
[2]
系统TDP值为0.999 999 999 999 999 999 02。通过一例实际案例对个体效能进行了比较。
5、在案件应用中的研究。通过对一些案件中现场血样、精斑、毛发、烟头唾液斑、软骨等共26份检材用Chelex100法提取（较新鲜检材、微量检材如唾液斑）或DNA提取纯化（陈旧较为腐败检材如陈旧血斑、从腐败尸体提取的软骨）用Sinofiler系统PCR，结果这26份检材均得到了很好的分型。结果表明，Sinofiler. PCR试剂盒对于陈旧、腐败或微量检材，PCR结果也较为理想。
- ２ -
南方医科大学生物医学工程系 孙全明毕业论文
1 材料和方法
1．1 样本来源：
1.1.1血样：广东地区汉族231名无亲缘关系成年人（汉族）滤纸血样。
1.1.2案件检材：案件中现场血样、精斑（包括陈旧现场血斑和精斑）、毛发、烟头唾液斑、腐败尸体软骨等不同的共26份检材。
1.2 主要仪器及试剂
1.2.1仪器设备：
（1）PE 480型热循环仪(PE公司,美国) （2）PE 9700型基因扩增仪(PE公司,美国) （3）3100型DNA测序仪(ABI公司,美国) （4）1-13型高速台式离心机(Simga,德国) （5）Vortex-Genie 2型旋涡混合型(美国) （6）Bp61S型分析电子天平(Satorius,德国) （7）Milli-QA型超纯水制备系统(Millipore,美国)
（8）2μl，10μl, 20μl, 100μl, 200μl，1000μl微量加样器(Gillson法国) （9）眼科剪、眼科镊 （10）0.5ml Eppendorf管
（11）PCR 96孔板(AXYGEN , 美国) 1.2.2试剂部分:
（1）10% chelex-100 溶液(Simga,德国) （2）Taq DNA 聚合酶(AB公司, 美国) （3）Gold Taq DNA 聚合酶 (AB公司, 美国) （4）10% PK(CALBIOCHEM,德国)
（5）Buffer (10x) with EDTA (AB公司,美国)
（6）GeneScan TM -500 LIZ Size Standard 分子量标准 (AB公司, 美国)，范围：35 bp -500 bp，大小分别为35 bp，50 bp，75bp，100bp，139 bp，150 bp，160 bp，200 bp，250 bp，300 bp，340 bp，350 bp， 400 bp, 450 bp,490 bp,500 bp。
- ３ -
南方医科大学生物医学工程系 孙全明毕业论文
（7）Matrix Standard Set DS-30 Matrix试剂盒。(AB公司, 美国) （8）3130 POP_4TM(performance Optimized Polymer 4) (AB公司,美国) （9）Hi-DiTM Formamide (AB公司,美国) （10）去离子水
（11）QIAamp DNA Micro Kit(50)试剂盒 （12）1M DTT溶液 （13）10% SDS溶液
1.3 DNA提取
1.3.1血样：用Chelex 100法
2
[17-19]
（1）用眼科剪剪取4mm血斑，放入0.5ml的Eppendorf管里，加入0.4ml双蒸水，振荡,室温放置15min；
（2）13,000cpm离心3min，去上清液，沉淀物中加入180μl 10% Chelex 100溶液，震荡混匀，56℃干浴中保温30min； （3）震荡混匀，干浴100℃保温8min；
（4）13,000rpm离心3min，取适量上清液用于PCR扩增。 1.3.2案件中现场血样、精斑、毛发、烟头唾液斑、软骨
1.3.2.1 较新鲜的检材如现场血样、毛发、烟头唾液斑、精斑用Chelex 100法
（1）用眼科剪剪取4mm血斑/带毛囊的毛发一根，毛囊剪取3mm/烟头过滤嘴处剪取9mm/精斑剪取9mm（先用差异裂解法消化掉女性成分：放入1.5ml的Eppendorf管里，加去离子水1ml，PK50μl，SDS100μl,混匀，37℃水浴中保温2小时以上。套管13,000rpm离心3min，去上清液和载体，沉淀加1ml去离子水洗涤三次，然后镜下观察女性上皮消化情况），分别放入0.5ml的Eppendorf管里，加入0.4ml双蒸水，振荡,室温放置15min； （2）13,000cpm离心3min，去上清液，沉淀物中加入试剂见表1.3.1：
表1.3.1 沉淀物中加入试剂
2
2
2
检 材 血斑 毛发 烟头过滤嘴 精斑
180μl 10% Chelex 100溶液
试 剂
30μl 10% Chelex 100溶液+DTT3μl +PK3μl 100μl 10% Chelex 100溶液+ 10μl PK
100μl 10% Chelex 100溶液+DTT 10μl +PK 10μl
- ４ -
南方医科大学生物医学工程系 孙全明毕业论文 震荡混匀，56℃干浴中保温2小时以上；
（3）震荡混匀，干浴100℃保温8min；
（4）13,000rpm离心3min，取适量上清液用于PCR扩增。 1.3.2.2 软骨等腐败检材用QIAamp DNA Micro Kit(50)提取纯化
[20]
。
1.4 PCR扩增
1.4.1 扩增反应体系及循环参数 使用Sinofiler试剂盒进行PCR复合扩增 1.4.1.1扩增体系（25ul体系）：
PCR Reaction Mix primer Set Ampli Taq Gold 取
DNA样品＋ddH2O
1.4.1.2 扩增程序：
95℃ 11分钟 ↓
94℃ 1分钟 ↓
59℃ 1分钟 28个循环 ↓ 72℃ 1分钟 ↓ 60℃ 60分钟 ↓ 4℃ 保温
10.5?μl 5.5?μl 0.5?μl 15.0?μl 10.0?μl
- ５ -