南方医科大学生物医学工程系 孙全明毕业论文
1.5 PCR扩增产物的检测
1.5.1 样品准备：
96孔板每一样品9.75ul Hi-D Formamide(或去离子水)＋0.25ul GeneScan TM -500 LIZ内标+1.0ul扩增产物，95℃变性5分钟，放入碎冰中中5分钟以上---每次检测要加Ladder、阳性对照9947A、阴性对照（加去离子水）。将橡胶密封盖盖上96孔板，放入3100的黑色底座，最后盖上白色盖子，盖紧，离心。 1.5.2 仪器准备：
(1)配电泳缓冲液：准备200 ml去离子水，在干净量杯中加2.5ml 10×Buffer缓冲液，再加22.5ml去离子水，混匀。
(2)水槽换水：2、4号水槽换去离子水。 (3)灌胶：POP-4胶2ml
(4)确定毛细管空间定位校准的质量：看画面上波峰是否尖，每个毛细管之间的峰尖位置相差是否为15－16，主要信号强度在2000以上。
(5)电泳条件：长36cm的毛细管；管内凝胶为POP4胶液；进样电压3000伏，进样时间10秒；电泳温度60℃；电压为1.5万伏，电流为12mA,功率为9.9W电泳 45 min。 1.5.3 上样：
将离心过的96孔板上机并启动Run运行。 1.5.4 分析：
Data CollectionV2.0软件收集数据，应用Genemapper ID V3.2软件对电泳结果进行分析：见内标100-350峰处， Ladder和样品片段大小差异在±0.5内。9947A峰高在1000-4800rfu，峰形正常，比对9947A数据，数据一致。Ladder峰形可信、峰高在160-360rfu。
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南方医科大学生物医学工程系 孙全明毕业论文 内标峰形可信、峰高在320-5000 rfu。空白对照未出正常峰形。分型图举例如图1.5：
图1.5
1.6 微变异体等位基因及稀有等位基因的命名
[2，21]
1.6.1微变异体等位基因的命名
本研究发现有一些基因座有一个等位基因“off-ladder-allele”峰，将这些含有“off-ladder-allele”峰的样本再次检验进行复核，发现结果与原检验结果一致。核实该样品的分子量内标准确，检查样品等位基因与ladder中相应等位基因的片段大小，计算各个等位基因样品与ladder的大小差异δ1与δ2。根据δ1与δ2计算杂合子个体的二个等位基因之间的相对漂移多少个bp，并对此off-ladder-allele等位基因进行命名。计算举例如下：
样本2890在D7S820基因座有一个等位基因“off-ladder-allele”峰和一个等位基因11（如图1.6.1），其中“off-ladder-allele”峰位于等位基因9和10之间。计算杂合子个体的二个等位基因之间的相对漂移，此“off-ladder-allele”峰比等位基因9大1个bp，那么它是D7S820基因座的一个真正的等位基因9.1。
样本2890：δ1=S9-L9=267.62-266.81=0.81bp δ2=S11-L11=274.85-274.80=0.05 bp c=∣δ1-δ2∣=∣0.81-0.05 ∣=0.76 bp 1.6.2 稀有等位基因的命名
本研究发现一些稀有等位基因出现在Ladder之外，小于最小的等位基因，如在D6S1043
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南方医科大学生物医学工程系 孙全明毕业论文 基因座，出现了小于等位基因9的一个峰，此时参考9和10之间的分子量差值，将此峰命名为8. 1.6.3 测序 由SBS公司完成。
1.7 统计学处理
1.7.1 等位基因频率和法医学参数的计算
用powerstate软件计算等位基因频率和法医学参数。将每个个体的分型数据输入powerstate软件（Excel表格），得到每个基因座的等位基因频率(frequeney)、杂合度H (heterozotes)、偶合率 (probabilityofmatch，PM)、个体识别率 (Power of Discrimination，DP)、非父排除率 (Power of Exclusion，PE)、多态性信息总量 (P orphisminformationeontent，PIC)等群体遗传学参数。根据软件计算出的各基因座DP、PE数据。累积偶合率和累积非父排除率根据文献计算。
1.7.3 遗传平衡（Hardy一Weinberg）定律的检验
用powermaker软件进行遗传平衡检验（精确检验），以0.05作为显著性差异界限。 1.7.4 连锁不平衡检验
用Arlequin软件（ v3.11）进行各基因座之间的连锁不平衡检验（精确检验），以0.05作为显著性差异界限。 1.7.5 其他人群的资料比较:
使用R×C表卡方检验进行群体间的比较?以0.05作为显著性差异界限。
2 结 果
2.1 AmpF.STR? Sinofiler. PCR试剂盒15个基因座的群体数据资料
我们调查了广东地区231个无关个体的15个 STR基因座的基因型。在15个基因座中，等位基因最多的是D6S1043 (共发现17个等位基因)，最少的是CSFIPO 与D3S1358 (二者均只发现6个等位基因)。基因型频率分布在0.0022-0.3788之间，各基因座等位基因中频率最高的为CSF1PO的12(0.3788 )。详细结果见表2.1。
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表 2.1 广东地区 Sinofiler试剂盒15 个STR基因座
基因分布频率及统计学参数(n = 231)
Allele D16S539 5 6 7 8 9 9.1 10 11 12 12.2 13 13.2 14 14.2 15 15.2 16 16.2 17 17.2 18 19 19.3 20 20.3 21
0.0216
0.0043
0.1082
0.0022
0.1212 0.2251 0.2186
0.0519
0.0108
0.0152 0.2835 0.0022
D7S820
0.0043 0.1710 0.0628 0.0065 0.1537 0.3377 0.2100
0.1385
0.0065
0.0238
0.0714
0.1515 0.3766 0.2186
0.0303
0.0887
0.1667 0.2814 0.1472
D5S818
0.0152
D13S317
0.2338 0.1342
0.2338 0.2424 0.3788
0.0887
0.0065
0.1840
0.1905
0.2338
CSF1PO
0.0498
0.0996 0.0628 0.1277
D8S1179
0.0022 0.0043
D18S51
0.0022
D6S1043 D19S433 D3S1358
0.0043
vWA
FGA
D12S391 D2S1338 D21S11
0.0022 0.0065
0.0022 0.0368 0.0022 0.0022 0.1039 0.0087 0.0390 0.1277 0.0260
0.1494
0.0325 0.1537 0.0368 0.1450
0.0022
0.0303 0.0628
0.0022
0.0195 0.0130
0.0022 0.0476 0.1061 0.1623 0.0325 0.0108
0.2143 0.1450 0.2706
0.2229 0.1385 0.2576 0.0519 0.2251 0.1667 0.0173 0.0606 0.3528 0.0281
0.0108 0.3290 0.1818
0.0087
0.0065 0.0065 0.1234 0.0628
0.0563 0.0390 0.0022 0.1861 0.2944
0.0758 0.1883 0.0238 0.2143 0.1299 0.0043 0.0649 0.0455 0.2489 0.1710
0.0087 0.0541 0.1472 0.1385 0.0043 0.1320 0.1104 0.0173
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21.2 21.3 22 22.2 22.3 23 23.2 24 24.2 25 25.2 26 26.2 27 28 28.2 29 29.2 30 30.2 30.3 31 31.2 32 32.2 33.1 33.2 34.2
0.0065
0.0065
0.0130
0.0022
0.0022
0.0022
0.0108
0.0022 0.0541 0.0065 0.2251 0.0043 0.2879 0.0195 0.0043 0.1234 0.0801 0.0152 0.1342 0.0022 0.0346 0.0065
0.1342 0.0758 0.0346 0.0065
0.2619 0.0455 0.1970 0.0065 0.0108 0.0087 0.0411 0.0022 0.0130
0.1775 0.0108 0.1364 0.0801 0.0087 0.0952
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