前
言
HLA复合体位于6p21.31，全长约3600kb，占人体整个基因组的1/3000[1]，是迄今所知最复杂的人类基因复合体。本研究所涉及的是经典HLA I类基因及免疫功能相关基因中的抗原递呈相关基因。HLA分子不仅参与移植排斥反应，而且在免疫细胞的发育和应答过程中发挥更为重要的作用。近20年来的研究表明，HLA I类分子具有重要的免疫生物学功能
[2]
：一方面，HLA I类分子直接参与抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC）对内源性
抗原的加工和处理；另一方面，在TCR (T cell receptor) 特异性识别APC递呈的抗原肽过程中，必须同时识别与抗原肽结合成复合物的HLA分子，才能产生激活T细胞的活化信号，这就是所谓的MHC限制性。HLA复合体通过参与抗原递呈、制约免疫细胞间的相互作用、控制机体免疫应答的发生及强度等多个方面参与免疫调节。可以想象，HLA I类分子抗原递呈途径中任何一个环节发生异常，都会影响HLA I类抗原的表达及机体正常的免疫功能。
多年来，国内外的研究已经证实在许多肿瘤中发现HLA I类抗原表达降低或缺失，使肿瘤细胞不能被CTL识别和杀伤，逃避宿主的免疫攻击得以生存和发展。肿瘤细胞HLA I类抗原表达降低有多种类型[3]，研究表明，在各型肿瘤中全部HLA I类分子降低的频率从16-50%不等，HLA I类基因位点或等位基因的选择性降低的频率也不同（4-35%）。研究还发现各型肿瘤的转移瘤中HLA I类抗原降低的频率也不同（37-69%），并且转移灶比原发灶降低的频率更高。为此在第13届国际组织相容性抗原会议上成立了一个工作组（IHWG），组织有关实验室利用一套标准的试剂和方法以研究各型肿瘤HLA I类抗原降低的频率，并通过肿瘤的组织病理学特征、病程和HLA I类抗原表达水平的关系来评价各型肿瘤HLA I类抗原降低或缺失的临床意义。研究发现在多种类型的人类肿瘤中HLA I类抗原和/或TAP表达的降低与肿瘤的级别、病程以及预后不良的标志(如病灶的厚度、疾病的阶段、发病间隔和生存期等)有关[4]。通过病程分析CTL对肿瘤细胞的反应显示,复发的病灶中CTL识别所需的HLA I类限制性成分出现进行性的丢失[5]；在早期对T细胞免疫治疗有效的病人中,其复发的转移瘤的HLA I类抗原已丢失[6]。因此,应根据肿瘤细胞抗原加工机制和HLA I类抗原表达和功能的完整与否来选择病人进行T细胞免疫治疗。
肿瘤细胞上HLA I类分子异常表达的分子基础是多样的，主要体现在（1）基因水平的
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改变。 如在结肠癌，肺癌和恶性黑色素瘤中发现β2m基因的点突变或大片段的缺失而导致HLA I类分子的异常表达[7-9]；染色体不分离或有丝分裂的错误重组所引起HLA I类等位基因选择性降低。已经证实杂合性丢失可以通过影响HLA分子的表达参与到肿瘤发生的机制之中[10]。由于HLA基因的复杂性，目前的研究多用微卫星DNA作为遗传标记研究HLA基因的LOH。在已有研究中，不同的肿瘤中HLA基因杂合性丢失的频率不同，且数据相差较大(宫颈癌 50%，头颈部鳞状细胞癌 49%, 结肠癌13.8%, 喉癌 17.6%, 黑色素瘤 15.3%)[11]。已经发现一条6号染色体的部分或全部丢失是导致HLA单倍型丢失的主要原因[12-13]。（2）转录水平调节缺陷而导致HLA I类分子特异性位点的下调[14-16]。Griffion等发现黑色素瘤细胞系中ISRE (interferon stimulate reaction element; ISRE) 结合的转录因子改变引起HLAI类分子B抗原的表达下调。（3）抗原加工递呈的缺陷。Restifo等[17]首先在小细胞肺癌细胞系中描述了肿瘤细胞抗原加工的缺陷，发现由于TAP1和TAP2的降低而导致抗原的加工和递呈过程发生缺陷。肿瘤细胞中LMP2或LMP7缺陷对HLA I类抗原表达的影响是微妙的。它可改变HLA I类分子传递的抗原肽类型而不影响HLA I类抗原的表达水平
[18]
。
最新的调查结果表明，全世界胃癌的发病率和死亡率均居于首位，在我国，尽管在过
去的20年中，由于医学的发展，癌肿总体死亡率有所降低，但胃癌的5年存活率仍然很低，严重影响了病人的生活质量。为进一步提高胃癌患者的存活率，需要深入了解胃癌的病因学及其发展过程，并积极研究相应的肿瘤免疫治疗策略。关于胃癌中HLA分子表达情况的研究，在80年代末及90年代初国内外已有报道。但因为抗体的限制，研究不够系统、全面，涉及到分子机制领域的研究甚少。而关于胃癌中HLA及β2m基因区域等位基因LOH的研究，国内外均未见报道。基于此，我们利用石蜡切片的免疫组化技术对临床标本进行回顾性研究，探讨胃癌中HLA I类及相关分子的异常表达情况，同时利用第13届“HLA表达和肿瘤”国际组织相容性工作组大会上确立的一套研究LOH所需要最低数目的STR及技术标准和定义LOH的准则[19]，检测胃癌组织HLA和β2m基因区域异常丢失的情况。这不仅有利于进一步理解肿瘤的免疫逃避机制，而且对提高肿瘤细胞表面HLA I类分子的表达、增强免疫治疗的效果，为今后成功进行肿瘤的分子免疫治疗提供实验依据。
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1材料和方法 1.1材料 1.1.1临床标本
185例原发性胃癌标本取自南京××医院及××市第一人民医院1994年至2002年手术切除标本，常规石蜡包埋，切片，经病理医师明确诊断。男性148例，女性37例，年龄27～80岁。其中22例有癌旁胃粘膜组织，20例有淋巴结转移标本。
50例原发性胃癌新鲜手术标本取自2002～2003年南京××医院、××省肿瘤医院及××市第一人民医院，包括其相应的正常组织，立即用OCT包埋，液氮速冻，-700C冰箱冻存备用。全部病例经病理诊断明确。
1.1.2 主要试剂【所用的所有试剂均可记述，且注明规格、生产厂家】 1） 单克隆抗体
应用于石蜡组织免疫组化的单克隆抗体：
HC10 (抗HLA-B/C)、HCA2（抗HLA -A）工作浓度均为1:100，L368（抗β2m）和SY-1（抗LMP2）的工作浓度分别为1:50和1:200，无关抗体MK2-23的工作浓度为1:100。 应用于冰冻组织免疫组化的单克隆抗体：
LGIII-147.4.1（抗HLA-A）、B1.23.2（抗HLA-B/C）、TP25.99.8.4（抗HLA-A，B，C）、L368（抗β2m）工作浓度均为1:20，W6/32（抗HLA I类分子复合物）工作浓度为1:50。 所有鼠单抗为美国S.Ferrone博士惠赠
2） ABC试剂盒 （美国Vector公司产品，含有正常马血清、生物素标记的马抗鼠
二抗、Avidin、Biotin）
3） DAB试剂盒 （美国Vector公司）
4） Harris苏木素液：苏木色精2.5g，钾明矾50g，氧化汞1.25g（均为上海化学试剂公
司产品），无水乙醇25ml，冰醋酸20ml，蒸馏水500ml。将苏木色精溶于纯乙醇中，加入预先已溶解钾明矾的蒸馏水中，使溶液尽快沸腾后，将火焰熄灭或稍有火，慢慢加入氧化汞，防止溶液溅出，稍煮。将烧瓶立即浸入冷水中，当溶液冷却后，加入醋酸。
5） 0.01M PBS（PH=7.4）：Na2HPO4.12H2O 2.902g， NaH2PO4.2H2O 0.296g ，NaCl 8.5g，
加蒸馏水至1000ml，调PH至7.4。
6） 柠檬酸盐抗原修复缓冲液：80ml dH2O中溶解0.8765g NaCl和0.441g柠檬酸三钠，
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调节PH至6.0，加dH2O定容至100ml。 7） Tween-20
8） 中性树胶（福州迈新）：加入少许二甲苯。
9） 多聚赖氨酸（福州迈新）：用蒸馏水配制10%多聚赖氨酸。 10）其他均为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器及材料【所用的所有仪器均可记述，且注明厂家】 1） 切片机 （美国Reichert HistoSTAT） 2） 孵箱 （隔水式电热恒温培养箱） 3） 电热恒温鼓风干燥箱 （上海精宏实验设备有限公司） 4） 冰箱 （中国海尔） 5） 显微镜 （日本OLYMPUS） 6） 天平 （上海天平仪器厂） 7） 耐高温塑料染色架 （福州迈新） 8） 免疫组化染色孵育盒（自制） 9） 免疫组化笔 （日本PAP Pen） 10）磨砂载玻片
1.2方法【要详细记述说使用的方法，这点与发表论文有些不同。】 1.2.1 组织切片处理
载玻片预先清洗后用10%多聚赖氨酸处理5分钟，烤干备用。石蜡组织切片厚度为4μm，捞片后放入600C烤箱中2～3 h，室温保存备用。
新鲜胃癌组织经OCT包埋，固定，修块后切片，冰冻切片厚度为4～6μm，室温干燥30 min，40C冷丙酮固定后-20℃保存备用。 1.2.2 石蜡切片免疫组化染色步骤
1） 石蜡切片脱蜡水化：组织切片60℃ 烘箱烤片20 min，二甲苯 3×5 min ，100%乙
醇 1×5 min，100%乙醇 1×1 min，95%乙醇 2×1 min，70%乙醇 1×1 min，过水，PBS冲洗 3×3 min。
2） 每张片子加一滴或50 μl 3% H2O2，以阻断内源性过氧化物酶的活性室温15 min。 3） PBS冲洗3×5 min。
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4） 微波抗原修复：将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有已煮沸缓冲液（4.2 ml柠
檬酸盐缓冲液+450 ml H20）的烧杯中，中火15 min，解冻8 min。将烧杯取出，浸入冷水中（不可将玻片从缓冲液中取出冷却）。
5） PBS冲洗，将切片组织周围擦干，用免疫组化笔画圈，稍干。 6） PBS冲洗3×5 min。
7） 每张片子加一滴或50 μl的2%正常马血清，室温30 min。 8） 每张片子加一滴或50 μl的一抗，370C 60 min或40C过夜。 9） PBST（0.03% Tween-20+ PBS）冲洗3×5 min。
10）每张片子加一滴或50 μl生物素标记的马抗鼠二抗（用PBS稀释为1：200），
370C 60 min。
11） PBST冲洗3×5 min。
12） 每张片子加一滴或50 μl亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（A 20μl + B 20μl
+PBS 1 ml，用前半小时配），370C 30 min。 13） PBST冲洗1×5 min，PBS冲洗2×5 min。
14） 每张片子加2滴新鲜配制的DAB溶液，镜下观察染色深浅， 染好立即中止,用自
来水轻柔冲洗15 min。
15） 苏木素复染，自来水冲洗泛兰，1%盐酸酒精分化，自来水冲洗10分钟，梯度酒
精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.2.3 冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片4～6 μm，室温放置30 min后，入4℃丙酮固定20 min，PBST冲洗，5 min×3。用3%过氧化氢孵育10 min，消除内源性过氧化物酶的活性。PBST冲洗，5 min×3，下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。 1.2.4 判断标准
石蜡切片：阳性为棕黄色或棕褐色。计数着色细胞数和染色强度（两人单独计数）：整张切片中着色的癌细胞或癌旁细胞的百分数>75%、75～25%、<25%分别为阳性、弱阳性和阴性，染色强度分为强、弱和无，两种计分结果相加综合打分为＋、±、－。相邻正常结构（如淋巴和内皮细胞）可作为内对照来评价细胞的染色强度，无关抗体MK2-23作阴性对照。坏死的胃癌细胞不计数。
注：本实验结果判定方法是按照第12届国际组织相容性大会上确定的统一标准[47] 。
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