结论一致，但Lopez-Nenot MA[48]等认为其表达弱且不均一。结果的差异可能与各实验室所选用的方法、试剂和判定标准不同有关。此外，由于HLA的表达存在个体的差异性，某些个别病例并不能反应正常胃粘膜HLA分子表达的整体情况。因此，我们的研究结果表明正常胃粘膜HLA I类及相关分子的表达是稳定、均一的。
胃癌细胞HLA I类及相关分子表达有明显的下调或缺失。细胞表面的HLA I类分子是由重链、轻链和抗原肽共同组成的三元复合体，重链、轻链基因突变或I类分子依赖的抗原加工递呈分子缺陷均可导致I类抗原表达下调或缺失。本实验显示，胃癌中HLA重链各分子和HLA I类分子复合物表达下调显著，而且重链各分子与HLA I类分子复合物表达下调密切相关，尤以HLA-B/C抗原显著（P<0.05）。轻链和一种抗原加工分子LMP2的改变较少，且与I类抗原的下调和丢失无统计学意义。这些数据表明HLA重链各分子可能是影响胃癌中HLA I类分子异常表达的重要因素之一。
胃癌细胞HLA I类抗原表达与病理学类型有关。随着腺癌分化程度的增高，HLA-I类分子表达下调和缺失率减低。185例胃癌石蜡组织中，HLA-B/C位点的表达下调与病理学分期相关，低分化腺癌的下调率显著高于高分化腺癌（P<0.05）。分化程度是组织成熟度的标志，分化低的癌组织，HLA I类分子表达下调及缺失率高，易于逃避宿主的T细胞杀伤，可能是分化程度低的癌细胞更易于扩散和转移的原因之一。50例新鲜胃癌组织冰冻切片免疫组化结果显示，HLA I类各分子表达水平与肿瘤分化程度无明显相关性（P >0.05）。可能与我们的样本例数较少，所用的抗体，组织材料的差异有关。基于目前的实验资料，只能就HLA分子表达与病理分级、临床分期的关系做一趋势性分析，如有可能应扩大样本量作进一步研究。此外，在20例原发胃癌转移灶中，40%病例HLA I类分子的表达均弱于原发癌。在头颈部恶性肿瘤，乳腺癌，肺癌等肿瘤中也存在这样的现象[52]，说明在机体的免疫选择作用下，HLA分子表达下调或丢失的肿瘤更容易逃避免疫攻击，发生远处转移。
本研究中，我们对石蜡和冰冻组织切片的免疫组织化学染色结果采用了不同的判断标准进行统计学分析，因为我们所收集的185例胃癌石蜡标本，仅有20例相应的癌旁组织，按照第12届国际组织相容性大会上确定的统一判定标准，了解胃癌组织HLA及相关分子的表达情况，无须相应的癌旁组织，其结果同样是安全可靠的。但是，为了与同例胃癌组织LOH的结果相对应，我们对50例胃癌及相应癌旁组织的冰冻切片采用了Lopez-nevot改良的方法作为判断标准，它不仅使我们可以了解肿瘤组织HLA及其相关分子的表达情况，同时对于了解正常胃粘膜上皮HLA及其相关分子的表达有一定的帮助。更为重要的是，依
15
据Lopez-nevot改良的方法，对HLA I类分子在胃癌及相应癌旁组织中的表达强度和表达面积进行综合对比分析，更能充分体现其表达的差异性，并且成为同例胃癌组织HLA及β2m基因区域等位基因LOH强有力的支持依据。
免疫组化技术[53]是近十年发展很快的原位杂交检测蛋白表达水平的技术。随着单抗的大量涌现，其应用领域从新鲜组织的冰冻切片扩展到病理存档的石蜡切片，并以其快捷性、方便性、应用范围广而成为临床科研领域广泛应用的技术。免疫组化结果的判断带有一定的主观性，不同的判断标准会带来一定程度上的偏差。本实验室作为“HLA表达与肿瘤”国际参考实验室，采用的是第十二届国际主要组织相容性会议所制定的标准[54]。免疫组化技术中存在的另一个问题是假阳性、假阴性的问题。为解决这一问题，在每次实验中都设置了阴性对照、阳性对照及空白对照；同时考虑到抗原修复的方法及强度是影响整个免疫组化结果的关键步骤。在进行正式实验前，进行大量的预实验，针对每种单抗摸索出包括抗原修复在内的一套标准Protocol，保证正式实验结果的可靠性、准确性及可重复性。免疫组化的结果提示，HLA I类分子的表达可能与癌细胞的分化有关。通过肿瘤细胞分化程度影响HLA I类分子的表达，从而亦影响了肿瘤抗原的递呈，使肿瘤细胞逃避宿主免疫监视，最终导致癌肿的发生和转移。
近年来体外诱导特异性的T淋巴细胞回输给肿瘤患者是肿瘤免疫治疗领域的一个热点
[55]
。但本实验室的研究及其他报导均证实胃癌中有明显的HLA I类分子表达下调或缺失，
是一类免疫原性较弱的肿瘤，对T细胞依赖性的免疫治疗效果差。因此，在对这类病人的免疫治疗前，通过免疫组化等方法选择HLA分子表达阳性，对T细胞依赖性免疫治疗敏感的病例是非常必要的。其次，对于胃癌中大量存在的HLA分子表达下调或丢失的机制进行研究，在分子水平寻找提高其表达的方法，对于HLA分子缺陷肿瘤患者的治疗也是必需的。
16
结论
4结论【准确、明了】
胃癌是我国发病率最高的肿瘤之一。本研究应用HLA 及其相关分子单抗，采用免疫组织化学方法（ABC法）研究胃癌组织中HLA分子的表达情况，分析各分子表达与临床分期及病理分极的相关性；并应用微卫星多态性分析技术进一步探讨其异常表达机制，得到以下结论：
1.癌旁胃粘膜HLA I类抗原及相关分子表达阳性，胃癌组织HLA-A、HLA-B/C、HLA-ABC、和W6/32分子表达下调显著（P<0.05）；β2m和LMP2表达也呈下调趋势，但未见有统计学差异。其中HLA-A和HLA-B/C分子与HLA I类分子复合物表达下调密切相关，尤以HLA-B/C抗原显著。
2.HLA-A、HLA-ABC、和W6/32、β2m和LMP2分子在肿瘤的不同分级、分期无显著性差异；而HLA-B/C的表达与肿瘤的分级有显著相关性，随着腺癌分化程度的减低，HLA-I类分子表达下调和缺失有逐渐增高的趋势。
3.胃癌组织HLA-I类分子表达与淋巴结转移有关。40%的淋巴结转移灶HLA-I类分子表达低于原发癌。
4.胃癌组织HLA基因区域LOH的频率为18.3%，β2m基因发生LOH的频率为14.5%。本研究提示HLA重链基因区域的LOH可能是影响HLA I类分子异常表达的重要机制之一。
17
致谢
致 谢
首先感谢江苏省自然科学基金委员会对本课题给予的资金项目资助 （课题名称：胃癌HLA I类分子表达下调机制的研究，资助项目号：BK 055，项目负责人： 教授，起止日期：2002-2005）。
三年的研究生生活，我有幸得到了***授的悉心指导和无微不至的关怀。在我的三年学习和科研道路上，导师倾注了大量的心血。导师严谨求实的治学态度，兢兢业业的工作作风和始终对生活乐观开朗，不计较个人荣辱得失的高尚情操，一直深深地感染和鼓舞着我，使我学会克服学习，科研和生活中遇到的各种困难并坚持到底；导师忘我的奉献精神和真诚宽容的人品，必将使我受益终生；
感谢遗传中心的***教授，***教授，***高级工程师。他们孜孜不倦的敬业精神使我永生难忘；
感谢生物教研室***,***,**，***，**老师对我的帮助，在此表示衷心的感谢！！ 感谢***，***，***，***t同学对我的关心和帮助，珍贵的友情将伴随我一生； 最后我要深深感谢我的父母，我的兄长，是他们的全力支持和坚强后盾，才确保我能够顺利完成学业！
向所有关心，支持我的老师，亲朋好友表示最真诚的谢意！
18
致谢
参考文献【注意格式，各部分的顺序】
[1] 龚非力.医学免疫学. 北京：科学出版社，2000.125-149
[2] 刘建欣.现代免疫学-免疫的细胞和分子基础. 北京：清华大学出版社，
2000.166-190
[3] Garrido F, Ruiz-Cabello F, Cabrera T, et al. Implication for immunosurveillance of
altered HLA class I phenotypes in human tumours. Immunol Today ,1997, 18: 89-95
[4] Vitale M. Rezzani R. Rodella L. et al.. HLA class I antigen and transporter
associated with antigen processing (TAP1 and TAP2) down-regulation in high-grade primary breast carcinoma lesions . Cancer Research.1998, 58(4): 737-742
[5] Lehmam F, Marchand M, Hainaut P, et al. Differences in the antigens recognized
by cytolytic T cells on two successive metastase of a melanoma patient are consistent with immune selection. Eur J Immunol, 1995, 25: 34062. [6] Jager E. Ringhoffer M. Altmannsberger M. et al. Immuno selection in vivo:
independent loss of MHC class I and melanocyte differentiation antigen expression in metastatic melanoma . International Journal of Cancer.1997, 71(2):142-147
[7] Bicknell DC. Rowan A. Bodmer WF. Beta 2-microglobulin gene mutations: a
study of established colorectal cell lines and fresh tumors . Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1994, 91(11): 4751-4756
[8] Chen HL. Gabrilovich D. Virmani A. et al. Structural and functional analysis of
beta2 microglobulin abnormalities in human lung and breast cancer .International Journal of Cancer. 1996,67(6): 756-763
[9] Hicklin DJ. Wang Z. Arienti F， et al. beta2-Microglobulin mutations, HLA class I
antigen loss, and tumor progression in melanoma . Journal of Clinical Investigation.1998, 101(12): 2720-2729
[10] Garrido F, Cabrera T, Concha A, et al. Natural history of HLA expression during
19
致谢
tumour development. Immunol Today 1993:14:491-9.
20