冰冻切片：染色结果分别由两人按以下标准判断，以组织中淋巴细胞作为阳性参照对象，再根据肿瘤细胞是否被染色，分为阴性和阳性，阳性分成+，++，+++三个等级，染色强度为淡黄色，棕黄色，深棕色，分别记分为0，1，2，3。部分肿瘤组织染色不均一，根据肿瘤组织阳性面积计算，阳性面积≤25%，按阴性计算；阳性面积≥75%，按阳性计算;在两者之间，根据其染色强度减0.5（该标准参照Lopez-nevot的方法[48]）。 1.2.5 统计学分析
根据以上标准，结合临床病理资料进行分期、分级（TNM分级根据1987年制定的标准），统计每组各抗原的表达水平，用SAS 6.12软件对资料用列联表卡方检验进行统计分析。
2结果【根据实验的结果，分为几个部分分别书写，图文并茂，加入适当的表格。图、表的说明要规范！】
2.1 石蜡组织切片表达情况
染色结果显示：胃癌及癌旁组织细胞染色较均一，间质（内皮细胞、淋巴细胞）均表达阳性。HC10和HCA2染色以膜为主，β2m表达为膜浆型，以膜为主，而LMP2则表达在胞浆中(图1-6)。在22例癌旁胃粘膜组织中，大部分HLA I，β2m和LMP2表达为阳性，只有4例（18%）HLA I类分子表达阴性。与癌旁组织相比，HLA I类分子有明显的表达下调或缺失，B/C位点最显著（见表1）。β2m和LMP2有表达下调或缺失，但与I 类分子的下调或丢失无统计学意义。
表1 HLA I类抗原及相关分子在胃癌中的表达情况 ＋ ± －
HLA-B/C 37% 41% 22%
HLA-A 49% 32% 19%
β2m 55% 32% 13%
LMP2 73% 22% 5%
+：表达正常； ±：表达下调； －：表达缺失
2.2 冰冻组织切片表达情况
50例新鲜胃癌组织切片中淋巴细胞都表达HLA I类各分子，成为本实验良好的内参照。HLA各分子均表达在细胞浆或细胞膜表面，呈黄色或淡黄色（如图8-15），其表达情况同
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石蜡组织切片基本一致。胃癌组织中HLA I类各分子的表达与癌旁组织相比表达下调显著（图7），且HLA I类重链各分子及I类分子复合物表达下调有显著性差异（P<0.05见表2）。β2m表达也呈下调趋势，但无统计学意义（P>0.05）。
表2 胃癌及癌旁组织中HLA I类各分子的表达情况
HLA-A,B,
癌旁组织 胃癌组织
P
HLA-A 1.61±0.49 1.10±0.83 0.0008
HLA-B/C 1.70±0.52 1.30±0.97 0.0152
C 1.67±0.53 1.36±0.81 0.0546
β2m 1.36±0.61 1.11±0.90 0.2263
W6/32 1.85±0.56 1.24±0.92 0.0001
应用偏相关分析，HLA重链各分子与HLA I类分子表达下调显著相关，尤以HLA-B/C位点显著（P<0.05，相关系数rs=0.8236见表3）。β2m与HLA I类分子表达下调之间的相关性未见有统计学意义（P>0.05）。
表3 胃癌中HLA I类各分子与HLA I类分子复合物之间的关系 HLA-A 1.09±0.83 P<0.0001 rs=0.6943
HLA-B/C 1.27±0.96 P<0.0001 rs=0.8236
HLA-A，B，C 1.36±0.81 P<0.0001 rs=0.6775
β2m 1.11±0.90 P=0.0961 rs=0.3207
W6/32 1.24±0.92 —— ——
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图1 癌旁胃粘膜HLA-B/C抗原阳性染色 图2 胃癌HLA-A抗原阳性染色
膜型 ABC 法 400× 膜型 ABC 法400×
图3胃癌 LMP2抗原 阳性染色 图4淋巴结转移灶 HLA-A抗原阴性染色
ABC 法 400×浆型 （淋巴细胞阳性）ABC法 100×
图5 β2m抗原阳性染色 图6 MK2-23 阴性对照
膜浆型 ABC 法 400X ABC 法 100X
图7 胃癌中HLA I类分子的表达
图8 HLA I类分子复合物胃癌阴性染色 图9 HLA-A，B，C 抗原胃癌阴性染色
癌旁胃黏膜阳性染色 癌旁胃黏膜阳性染色 ABC法 100 × ABC法 100 ×
图10 β2m抗原胃癌组织表达阴性 图11 β2m抗原胃癌组织表达阳性
间质表达阳性 ABC法 100 × ABC法 100 ×
图12 HLA-B/C抗原胃癌组织表达阳性 图13 HAL-B/C抗原胃癌组织表达阴性
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ABC法 100 × 间质表达阳性 ABC法 100 ×
图14 HLA-A抗原胃癌组织表达阳性 图15 MK2-23 阴性对照
ABC法 100 × ABC法 100 ×
3讨论【围绕几个要点进行。参考论据要围绕你要说明的论点展开论述，切忌无病呻吟，不切合主题。同时讨论要深入，不要肤浅而显得太简单。】
从八十年代后期开始，Ferrone A, Lopez-Nenot MA, Teh M等陆续报导了胃癌中HLA分子的表达情况及其与病理学分型，临床预后的关系。但同其它肿瘤一样，由于各实验室所用的方法和试剂的不同，结论不尽一致，也不利于互相比较和归纳总结。为此，第十二届国际组织相容性抗原会议(IHWG)成立了“HLA表达与肿瘤”工作组，组织有关实验室利用一套标准的试剂和方法以研究各型肿瘤的HLA抗原的改变频率。并通过肿瘤的组织病理学特征，病程和HLA抗原表达水平的关系来评价各型肿瘤原发灶和转移灶中HLA抗原改变的临床意义。目前，国际上关于HLA分子在不同肿瘤中低表达或失表达的文献较多，主要的结论有以下几点：
(1)HLA I类分子在许多肿瘤中有低表达或失表达的现象。主要形式有5种[3]：① I类分子全部失表达或低表达：可能与β2m蛋白合成，抗原肽转运蛋白，MHC基因结构缺陷有关，这类表型的细胞系有淋巴细胞系Daudi，黑色素瘤FO-1，结肠癌COVO。② I类分子单倍型失表达：很少见，可能与染色体不分离和有丝分裂重组有关。③ A、B、C、TAP、LMP等位点选择性失表达：黑色素瘤HLA-B7下调与原癌基因c-myc的转录增加有关，可干扰HLA-B在启动子水平的转录。这种类型能被细胞因子治疗所逆转。④ I类分子某些特定等位基因选择性失表达：可能由于点突变、HLA基因部分缺失或基因断裂重组的结果，不能被细胞因子治疗所逆转。⑤ 复合表型：不能归纳为以上4种情况者。例如在转移的黑色素瘤上仅发现有HLA-A24表达[10]，另外还发现了HLA-B下调和HLA-A缺失造成的新表型[33]。
(2)HLA I类分子全部失表达以及特定位点选择性失表达的频率在不同种肿瘤中有差异（16-50%），在子宫颈癌、前列腺癌和黑色素瘤中失表达的频率高于头颈部癌、乳房癌、肺癌和结肠癌。
(3)HLA I类分子低表达的发生机制在不同肿瘤和个体中不同，主要涉及两方面：（1）
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基因突变或大片段缺失及表达调控异常；（2）抗原加工异常：TAP失表达会导致A、B、C在胞内不能与抗原肽结合，从而不能表达于细胞膜上；LMP失表达对A、B、C的表达水平无明显影响，但可改变它们提呈的多肽谱[18]。
(4)HLA I类分子和TAP的低表达常常预示着肿瘤的临床进程加快和预后不良。如：在多种肿瘤中，I类分子和TAP在转移癌组织中低表达频率明显高于原位癌组织；在黑色素瘤组织中，已证实它们的低表达与预后不良的判断指标（如原位癌组织的厚度、疾病的进展阶段、无症状的间歇期长短和存活率等）相关。
(5) 在黑色素瘤的研究中表明：HLA I类分子的低表达在体外培养中能导致肿瘤细胞对T细胞和NK细胞的敏感性丧失或降低；在体内，低表达能明显影响病人进行T细胞免疫治疗的效果。如在几个黑色素瘤病人中，HLA表达正常的原位癌阶段，T细胞免疫治疗的效果相当满意。当转移复发后，T细胞疗法则收效甚微。因此国际HLA工作组建议：在选择病人进行T细胞免疫治疗时，应常规检测癌组织中HLA I类分子的表达情况，把HLA低表达程度和功能的完整性作为是否治疗的标准。
本实验室利用IHWG提供的标准方法和试剂对江苏省185例胃癌石蜡标本和50例新鲜胃癌组织标本进行免疫组化染色，探讨HLA抗原及相关分子在胃癌组织中的表达及意义，其中胃癌石蜡标本部分数据已在第十三届国际组织相容性抗原会议上报导[49]。结果显示，石蜡与冰冻组织切片的免疫组化染色结果基本一致。
本研究用存档的石蜡组织进行免疫组化分析,方法简便,结果满意,使研究者能够获得丰富的材料进行回顾性研究,不受标本来源的限制,值得推广和应用。我们还对50例胃癌及相应癌旁组织的冰冻切片进行了免疫组化分析。已知HLA I类分子复合物是三聚体分子，细胞表面HLA I类分子复合物结构的完整性，是判断其是否具有功能的关键因素之一。能够准确、充分体现HLA I类分子复合物表达情况的单克隆抗体是W6/32，该抗体仅适用于冰冻组织切片，且新鲜组织的冰冻切片相对于石蜡组织切片，无须抗原修复等相应特殊步骤的处理，对组织抗原的破坏性小，其结果更加真实、可靠。此外，其他抗体均是位点特异性的单克隆抗体，不能真实地反映HLA I类分子结构和功能的完整性。更为重要的是，同例胃癌组织冰冻切片免疫组化与HLA基因区域LOH的综合分析，对阐明胃癌组织HLA I类及相关分子异常表达机制提供了良好的实验依据。
关于正常胃粘膜上皮HLA分子的表达存在争议。本实验胃癌石蜡组织与冰冻切片中，大部分癌旁胃粘膜上皮HLA I类抗原表达阳性，着色均一。这与Klein B[50], 张宏博[51]等的
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