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28℃恒温培养箱中培养。2d后，从培养皿中挑取单个分散的菌落移植到PDA培养基上进行纯化培养，然后转入PDA试管斜面保存[5]。
1.3 分离菌株致病性测定
根据柯赫氏法则[6]进行寄主活体接种测定。在田间选取健康的散尾葵叶片18片，用无菌水清洗叶片表面，在每其中9片叶面用消毒过的针轻轻刺伤叶片表皮，将纯培养在PDA上的1号、2号菌打菌饼（菌饼大小约为3mm）然后接种到叶片的伤口处，以无菌的PDA培养基块做对照并进行分组为A（1号）、B（2号）、C（CK），每组三个重复，剩余9片叶片按上述方法进行无伤接种处理（不刺伤叶片表皮），分别依次编号为D（1号）、E（2号）、F(CK)，保温保湿，5d后观察。如果该病原菌能使散尾葵发病，并与田间自然发病症状相比较，若存在相同症状则将长出的病斑采用1.2所述方法分离得到病原菌，并将两次获得的病原菌作比较，判断两次提取的病原菌是否相同，以确定该菌为致病菌。
1.4 生物学特性测定
1.4.1 不同温度对菌丝生长的影响
在无菌操作条件下，将直径5mm菌龄相同的菌饼移到PDA培养基平板中央，分别置于15、20、25、28、30和37℃的恒温培养箱中培养，观察菌丝生长情况，每天测量菌落直径，比较在不同温度下菌丝生长速率。5d后用十字交叉法测量菌落直径。每处理三个重复。 1.4.2 不同光照对菌丝生长的影响
将直径为5mm的菌龄相同（培养4d）的菌饼接种到PDA培养基平板中央，分别置于24h完全光照，12小时光照和黑暗交替，24小时完全黑暗3中环境中，在28℃恒温培养箱中培养，6d后测量菌落直径。每处理三个重复。
1.4.3 不同pH值对菌丝生长的影响
制作PDA培养基，用0.1mol/L的HCl和NaOH将其pH值分别调节到4、5、6、7、8、9、10这7个梯度，湿热灭菌（121℃,20min），再用无菌的0.1mol/L的HCl和NaOH重新调节pH值后倒入已灭菌的培养皿中制成平板[7]；用直径为5mm的打孔器，取菌落边缘的菌饼（在PDA平板上培
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养4d），接种到不同pH值的培养基平板中央，置于28℃恒温培养箱中培养，6d后观察菌落状况。每处理值三个重复。 1.4.4 不同碳源对菌丝生长的影响
使用Czapek固体培养基[8]为基础培养基：MgSO4·7H2O 0.5g, KH2PO4 1g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，NaNO3 2g(纯氮约0.3294g)，琼脂 20g，蒸馏水定容至1000mL。
另外，分别以等当量的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、D-果糖、D-甘露糖、D-木糖作为碳源（以20g葡萄糖含碳量为标准），配置成不同碳源[7]的培养基，湿热灭菌（121℃，20min），然后制成平板，在平板中央接入直径为5mm菌龄相同的菌饼；置于28℃恒温培养箱中培养，5d后观察菌落状况。每处理三个重复。 1.4.5 不同氮源对菌丝生长的影响
使用Czapek固体培养基为基础培养基：MgSO4·7H2O 0.5g, KH2PO4 1g，KCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，蒸馏水定容至1000mL。
另外，分别以等当量硝铵酸2.00g、硫氨酸1.53g、色氨酸2.40g、肌氨酸1.00g、蛋白胨4.00g、L-苯丙氨酸4.00g、磷酸二氢铵2.70g为氮源，配置成不同氮源的培养基，湿热灭菌（121℃,20min），然后制成平板，在平板中央接入直径为5mm菌龄相同的菌饼；置于28℃恒温培养箱中培养，5d后观察菌落状况。每处理三个重复。 1.4.6菌丝致死温度测定
将病原菌菌饼（5mm）移入已灭菌的试管内，塞上橡皮塞，分别45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃恒温水浴处理10min，然后再分别接种到PDA培养基平板中央，以未处理菌饼接种到PDA培养基平板中央为对照，28℃恒温培养箱中培养，5d后观察菌落状况。每处理三个重复。 1.4.7 病原菌产孢诱导及病原菌鉴定
由于未在培养基上获得病原菌孢子，设计了以下促使孢子产生的方法（表1）；观察菌落及分生孢子颜色、形态、以及分生孢子梗形态并测量孢子大小。
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表1 促使孢子产生的方法
培养基 散尾葵葡糖糖琼脂培养基 散尾葵琼脂培养基 燕麦片琼脂培养基 马铃薯琼脂培养基 散尾葵叶组织PDA培养基 散尾葵植株活体嫩叶 PDA 处理方式 28℃恒温培养箱中培养8d。 28℃恒温培养箱中培养8d。 28℃恒温培养箱中培养8d。 28℃恒温培养箱中培养8d。 28℃恒温培养箱中培养8d。 保温保湿直到叶病部灰白干枯，长出小黑点 28℃正常培养4d，紫外灯（200～275nm）照射20min，28℃恒温培养4d。 PDA 28℃正常培养4d， 12小时光暗交替，28℃恒温培养4d。 PDA 28℃，正常培养5d后，将培养皿置于5℃低温条件下2天，再转入28℃恒温培养3d。 PDA 28℃正常培养5d后，将菌丝挑出接种于无菌蒸馏水上，28℃恒温培养5d。 注：1、散尾葵葡糖糖琼脂培养基配制营养为：新鲜散尾葵叶组织20g，葡糖糖2g，琼脂2g，蒸馏水100mL。
2、散尾葵叶组织PDA培养基制作方法：将新鲜健康的散尾葵叶片表面消毒，剪成小块（约3mm×3mm）散置于PDA培养基平板上。
2 结果与分析
2.1 症状描述
该病原菌主要危害叶部，尤其是上部嫩叶。病菌最先侵染叶尖和叶缘，发病初期染病处呈褐色斑点或条块状斑块，中期斑点或斑块逐渐扩大并相互连接，渐扩展为条斑，并可汇合成不规则的坏死块，后期叶片呈现灰白状干枯，边缘有深色线条围绕；温湿条件下病部散生一些小黑点，轻者使叶片干枯，重者会导致植株整株死亡。（如图1A~D）
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2.2 分离菌株致病性测定
用田间自然发病的散尾葵病株分离获得纯菌种，按照柯赫氏法则进行接种，结果表明：刺伤接种A处理组3d后病原菌接种部位开始发病，出现水渍状小斑点，5d后染病处呈褐色斑点或条块状斑块，约10d后斑点或斑块逐渐扩大并相互连接，渐扩展为条斑，并可汇合成不规则的坏死块，最后叶片呈现灰白状干枯，边缘有深色线条围绕，温湿条件下病部散生一些小黑点，其发病率达100%；B处理组和C无发病现象。无伤接种D处理组5d后病原菌接种部位开始发病，其发病过程与刺伤接种A处理大体相似，发病率为66%，无伤接种E、F处理组无发病现象。
用获得的菌种接种后出现的症状与田间自然发病症状相同，从接种发病的植株分离获得的病原菌与田间自然发病获得的病原菌相同；对照植株生长良好，同样进行组织分离，无病原菌存在，证实分离菌是散尾葵叶枯病的致病菌。
A： 叶尖易受害；B：渐扩展为条斑，并可汇合成不规则的坏死块；C：病斑中心灰白色，边缘有深色线条围绕；D：叶片有一半以上干枯卷缩
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图1 散尾葵叶枯病发病症状
图2 病原菌在PDA上的菌落 图3 光照对病原菌菌丝生长的影响
2.3 不同温度对菌丝生长的影响
结果表明：病原菌在20～37℃均能生长；温度在15～28℃，菌落直径随着温度的升高而逐渐增加；温度在28～37℃范围内，菌落直径随着温度的升高而逐渐减小。试验中最适宜菌丝生长的温度为28℃，培养5d菌落平均直径达到41.5mm；15℃条件下菌丝生长受阻止或不能生长。所以菌丝生长的最适温度范围在25～30℃，而菌丝能否生长的低温临界温度在为15～20℃之间。（表2）
表2 温度对菌丝生长的影响
菌落直径温度℃ Temperature （5d/mm） Diameter of colony（5d/mm） 15 20 0.0aA 26.1bB 菌丝不生长，未有任何菌丝特征 菌落圆形、边缘较整齐、浅褐色、棉絮状，边缘菌丝稀疏，未产孢。 25 35.0cC 菌落圆形、边缘较整齐、褐色，菌丝生长旺盛，棉絮状，菌落平整，背面有褐色色素，未产孢。 28 41.5dD 菌落圆形、边缘较整齐、红褐色，菌丝生长旺盛，棉絮状，菌落平整，背面有黑褐色色素，未产孢 30 30.3eB 菌落圆形、边缘较整齐、褐色，菌丝生长旺盛，棉絮状，菌落平整，背面有深褐色色素，未产孢。 菌落特征（5d） Colony character（5d） 9