DBS44/ XXX—20XX 项 目 菌落总数/（CFU/g） ≤ 大肠菌群/（MPN/100g） ≤ 指 标 30000 90 检验方法 GB 4789.2 GB 4789.3 4.9 农药最大残留限量和兽药最高残留限量
4.9.1 农药最大残留限量应符合GB 2763《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》的规定 4.9.2 兽药最高残留限量应符合《动物性食品中兽药最高残留限量》（中华人民共和国农业部公告第235号）的规定。 4.10 净含量
应符合《定量包装商品计量监督管理办法》（国家质量监督检验检疫总局令〔2005〕第75号）的规定。 5 检验规则 5.1 批次、抽样 5.1.1生产企业
同日或同一班次、同一品种、同一规格的产品为一批。从生产企业成品库抽取。抽样数量为批量的1/1000，但不应少于6份独立包装，总重量不低于3000克。 5.1.2生产作坊
同日或同一品种的产品为一批。从作坊成品区抽取。抽样数量为每批抽取4份，总重量不低于2000克。 5.2 检验分类 5.2.1 出厂检验
5.2.1.1 产品出厂前，应由生产企业的质量检验部门或生产作坊的质量检验员按本标准规定逐批进行检验。无检测能力的生产企业或生产作坊应委托具备相关资质的检测机构检验。检验合格并签发质量合格证明的产品，方可出厂或出售。
5.2.1.2 出厂检验项目：感官要求、水分、菌落总数、大肠菌群、净含量、标签。 5.2.2 型式检验
5.2.2.1 型式检验项目：4.2-4.10要求的全部项目。
5.2.2.2 一般情况下，型式检验半年进行一次。有下列情况之一时，应进行型式检验：
a) 原辅料有较大变化时； b) 更改关键工艺或设备时；
c) 新试制的产品或正常生产的产品停产3个月后，重新恢复生产时； d) 出厂检验与上次型式检验结果有较大差异时； e) 国家食品药品监督机构有关规定需要抽检时。 5.3 结果判定
5.3.1 菌落总数、大肠菌群不符合本标准时，判定整批产品不合格，不得复检。
5.3.2 感官要求、水分、净含量、标签、牛源性成分含量如不符合本标准时，可以在同批产品中抽取双倍量的样品进行复检，以复检结果为准；如复检结果中仍有一项不合格，则判该批产品不合格。
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6 标签、包装、运输、贮存 6.1 标签
6.1.1预包装产品标签的标注内容除应符合GB 7718《食品安全国家标准 预包装食品标签通则》及GB 28050《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》要求外，还应标示产品中牛源性肉类含量、添加辅料名称及添加比例、非即食提示信息及烹煮方法。
6.1.2 散装产品应在盛装容器、外包装上标明产品中牛源性肉类含量、添加辅料名称及添加比例、配料表、生产日期、保质期、生产经营者名称及联系方式、非即食提示信息及烹煮方法等内容。 6.2 包装
6.2.1 预包装产品包装材料应符合相应标准和有关规定。包装箱应清洁、干燥、严密无破损。 6.2.2 散装销售产品盛装容器、外包装材料应符合相应标准和有关规定。盛装前应洗涤容器，避免污染
产品。
6.3 运输
产品应在-15℃以下运输、销售。产品装卸时要小心轻放，运输过程中应防止日晒雨淋及挤压碰撞，运输工具要清洁、卫生，不能与有毒、有害、有异味、易污染的货物混载。 6.4 贮存
产品应贮存在≤-18℃、温度波动±2℃的洁净库房内，不应与有毒、有害、有异味、易挥发、易腐蚀的物品混储。
7 生产加工过程的卫生要求
应符合GB 14881《食品安全国家标准 食品生产通用卫生规范》、GB/T 20940《肉类制品企业良好操作规范》和/或《广东省食品生产加工小作坊和食品摊贩管理条例》及附录B要求。 8 销售
8.1 应执行GB 31621《食品安全国家标准 食品经营过程卫生规范》要求。 8.2 应配备相应的冷藏、冷冻设备，并保持正常运转。
8.3 在经营过程中包装或分装的食品，不得更改原有的生产日期和延长保质期。包装或分装食品的包装材料和容器应无毒。
8.4 生产企业（作坊）如同时从事汕头牛肉丸批发业务的，应当建立食品销售记录制度，如实记录批发食品的名称、规格、数量、生产日期或者生产批号、保质期、销售日期以及购货者名称、地址、联系方式等内容，并保存相关凭证。 9 召回
应执行《食品召回管理规定》（国家质量监督检验检疫总局令第98号）。
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附录A
牛肉丸中牛源性成分含量检测 荧光定量PCR方法
A.1 范围
本方法规定了肉制品中牛源性成分含量的荧光PCR相对定量分析方法。 本方法适用于汕头牛肉丸中牛源性成分的相对定量检测。 A.2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本附录。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本附录。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 A.3 术语和定义
牛源性成分（Bovine derived materials）：牛种属特异性物质，本方法指的是牛种属特异性DNA片段。 标准汕头牛肉丸：按照本附录A.7.2制备的牛肉丸。
Ct值（Cycle threshold）：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 A.4 原理
荧光定量PCR技术，是指在荧光PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
锁核酸（Locked Nucleic Acid，LNA）探针是在传统Taqman探针的基础上，有目的地将一些碱基修饰成LNA碱基，即增加了探针的稳定性，又缩短探针长度，提高了探针的特异性和设计的灵活性，更适用于种属相近的动物源性成分检测。本方法通过设计特异性引物和LNA探针，检测牛特异性线粒体DNA序列来进行牛肉丸中牛源性成分的定量检测。 A.5 试剂和材料
除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，实验用水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
A.5.1 牛源性成分检测用引物（对）和探针序列为： 上游引物：5’-ttgaattaggccatgaagca-3’
下游引物：5’-cgacttgtctcctctcatgtagc-3’
LNA探针：5’-FAM-cgcccgtcaCcctcctcaaata-BHQ1-3’(探针中的“C”为LNA修饰碱基)
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A.5.2 荧光PCR反应试剂 A.5.2.1 Taq DNA 聚合酶。
A.5.2.2 dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。
A.5.2.3 10×PCR反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.4），200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl。 A.5.2.4 可使用等效荧光PCR反应试剂盒代替5.2.1～5.2.3。 A.5.3 DNA 提取纯化试剂
A.5.3.1 CTAB 裂解液：1% CTAB（cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），0.05 mol/L Tris-HCl（pH8.0）[Tris-：tris (hydroxymethyl) aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷]，0.7 mol/L NaCl，0.01 mol/L EDTA（pH 8.0）( ethylene diaminetetraacetic acid，乙二胺四乙酸)。 A.5.3.2 CTAB 沉淀液：CTAB 5 g/L，NaCl 0.04 mol/L，pH 8.0，高压灭菌。 A.5.3.3 NaCl溶液：1.2 mol/L。
A.5.3.4 蛋白酶K溶液：冻干品，用高压灭菌的去离子水溶解为 20 mg/mL 的溶液，分装后于-20 ℃保存，避免反复冻融。
A.5.3.5 三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇。
A.5.3.6 可使用等效DNA提取纯化试剂盒代替5.3.1～5.3.5。 A.5.4 荧光PCR反应管或反应板 A.6 仪器和设备 A.6.1 荧光定量PCR仪。 A.6.2 生物安全柜。
A.6.3 恒温干热器：温度37 ℃～99 ℃。 A.6.4 离心机：离心力不小于12000 RCF。
A.6.5 移液器：0.1 μL～2.5 μL、0.5 μL～10 μL、10 μL～100 μL、20 μL～200 μL、200 μL～1000 μL。 A.6.6 均质器：旋转式均质器，转速不低于8000 rpm/min。 A.6.7 天平：感量 0.01 g。 A.6.8 振荡器。
A.6.9 冰箱：-20 ℃～4 ℃。 A.6.10 高压灭菌器。 A.6.11 干热灭菌器。
A.6.12 离心管：使用密封性好的1.5 mL、2 mL规格离心管。 A.6.13 Tip：使用挂壁残留低的10 μL、200 μL、1000 μL规格吸头。 A.6.14 pH计 A.6.15 搅肉机 A.6.16 研磨皿 A.7 样品制备 A.7.1 检测样品制备
取3至5颗牛肉丸称重，用灭菌剪刀剪成直径小于5 mm的小块，与水按照1:4的质量比混合；均质6 min，没有密封圈的均质器要使用生料带密封接口处，以防均质时水分外溢。制备出均一的悬浊液，制样后必须在5 min内进行检测。 A.7.2 标准汕头牛肉丸制备
将大块牛腿肉剔除筋膜切成小块，称取1000 g置于洁净的砧板上，于＜22 ℃室温环境下，用铁棒或
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木棒槌打至肉糜状（或用搅肉机、研磨皿破碎至肉糜状），肉糜加工过程中加入100 g碎冰。将肉糜全部转移至洁净的容器内，加入淀粉20 g、食盐6 g，徒手搅拌均匀，一手紧握肉浆控制大拇指和食指成环状并挤出肉丸，用羹匙掏进45 ℃温水内温浴5 min。将肉丸转移至95 ℃水中煮25 min，捞出晾干后用封口袋分装，-20 ℃保存备用。 A.8 检测步骤
A.8.1 DNA 提取和纯化 A.8.1.1 CTAB法
每个样品设置2个提取平行，使用移液器取中层悬浊液50 μL置于2 mL离心管中，加入1 mL CTAB裂解液和20 μL蛋白酶K溶液，65 ℃温育1 h，期间震荡混匀3～5次，；12000 RCF离心5 min，取1 mL上清液于2 mL离心管中，加700 μL三氯甲烷，漩涡震荡30 s，12000 RCF离心10 min，收集600 μL上清液到新的2 mL离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温放置60 min；12000 RCF离心5 min，去除上清液，加350 μL NaCl溶液溶解沉淀，再加350 μL三氯甲烷，漩涡震荡30 s，12000 RCF离心10 min，转移上清液到新的离心管。加入转移上清液0.8倍体积的异丙醇，室温放置20 min，12000 RCF离心10 min，加500 μL 70%乙醇水溶液，漩涡震荡30 s，12000 RCF离心10 min；去除上清液，敞口于60 ℃恒温干热器中干燥15 min或18 ℃室内空调下放置30 min；加150 μL去离子水溶解沉淀，即刻用于检测或-20 ℃保存备用。
为减少操作误差：取样时须将Tip尖端以45°角剪去大约5 mm；移液时应轻柔细致，离心管尽量垂直，Tip尖端插入液面不得超过3 mm；转移上清时勿触及下层液体。 A.8.1.2 试剂盒法
采用商品化的DNA提取纯化试剂盒，按照试剂盒说明书提取DNA，但提取的悬浊液为50 μL，最终的DNA定容体积为150 μL。 A.8.2 荧光PCR检测 A.8.2.1 PCR 反应体系
PCR反应体系见表1。每管DNA设置2个扩增平行。
表1 实验室自备的PCR反应体系 试 剂 10×PCR反应缓冲液 dNTP溶液（10mmol/L） Taq DNA聚合酶（5U/μL） 上游引物(10μmol/L) 下游引物(10μmol/L) LNA探针（10μmol/L） DNA模板 补水至 加入量（μL） 2.0 0.4 0.2 1.0 1.0 0.2 2.0 20.0 A.8.2.2 PCR扩增条件
反应参数可根据具体的荧光PCR检测仪器型号和所用试剂的不同来设定，在一般反应程序基础上做适当调整。一般反应程序为：95 ℃，3 min；95 ℃，5 s, 59 ℃ 25 s，35个循环；在每个循环的退火阶段收集荧光信号。
检测过程中设置阳性对照、阴性对照和空白对照。
用标准汕头牛肉丸作为阳性对照，用非牛肉类肉丸（如猪肉丸）作为阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照。
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