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A.8.2.3 标准曲线的建立
使用标准汕头牛肉丸和非牛肉类肉丸（如猪肉丸）按不同比例混合，制成相对牛源性成分含量分别为100%、50%、25%、10%、1%及0.1%（m/m）的系列浓度标准样本。从提取DNA开始，每个定量样本各重复检测4次（各8次PCR扩增），检测后共获得48个Ct值，以ct值为横坐标，以log2（浓度）的绝对值为纵坐标绘制散点图，剔除明显偏离数据，保证有效数据不少于5个，制备标准曲线，并按照以下公式进行牛源性成分的含量计算。
y?12(ax?b)
公式中：y为牛源性成分含量；
X为检测的Ct值 a为标准曲线的斜率
b为标准曲线在x轴上的截距。
将构建标准曲线的Ct值分别代入公式，得出系列拟合浓度，统计出各定量点的扩展不确定度（95%可信区间）。
构建标准曲线和日常检测样品的所用方法和实验条件必须完全相同，标准曲线建立后可供多次使用。更改DNA提取方法、更换荧光PCR反应试剂，更新荧光PCR仪或仪器关键配件，必须重新制作标准曲线。 A.9 结果判断
A.9.1 结果分析条件设定
直接从荧光定量PCR仪上读取检测的Ct值。阈值的设定原则以阈值线刚好超过正常空白对照扩增曲线的最高点，同时可根据仪器噪声情况进行调整。 A.9.2 荧光PCR检测的质控
阳性对照：出现明显倒S型扩增曲线，且Ct≤25； 阴性对照：无扩增或Ct与阳性对照Ct之差＞7； 空白对照：无Ct值。 标准曲线：R2≥0.950。 A.9.3 样品结果的表述和判定
在质控成立的情况下，根据公式计算牛源性成分含量X.XX %(m/m)。在不超出允许差且高于定量限的前提下，报告检出的均值和相近检测浓度的扩展不确定度；超出允许差的，须复检。
检测的牛源性成分含量低于定量限时，以＜定量限来表述；检测的牛源性成分含量低于检测限时，报告未检出牛源性成分。 A.10 检测限和定量限
本方法的检测限为0.1%（m/m），定量限为1.0%（m/m）。 A.11 允许差
两个样本提取平行检测Ct值的改变＜0.4、扩增平行检测Ct值的改变＜0.2。 A.12 检测过程中防止交叉污染的措施
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按照GB/T 27403执行。 A.13 废弃物处理
检测过程中的废弃物无害化处理。
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附录B
生产加工过程的食品安全控制
汕头牛肉丸为地方特色产品，生产加工过程除应符合《食品安全国家标准 食品生产通用卫生规范》（GB14881）、《肉类制品企业良好操作规范》（GB/T 20940）和《广东省食品生产加工小作坊和食品摊贩管理条例》外，必须符合以下条文要求： B.1 厂房和制作间
B.1.1 按照产品工艺特点，应在厂房或作坊制作间设置与产品加工能力相适应的原料处理区、肉糜加工区、肉丸成型区、肉丸煮制区、预冷场所、包装间、原料仓库、成品冷藏库、工器具清洗间等功能区域。 B.1.2 各功能区域应按工艺流程的要求相对独立、分开，并按原料贮存、原料处理、肉糜加工、肉丸成型、肉丸制熟、预冷、包装、成品贮存等先后工序设置，避免交叉污染。 B.2食品加工人员卫生要求
B.2.1 不应配戴饰物、手表；不应化妆、染指甲、留长指甲、喷洒香水；不得携带或存放与食品生产无关的个人用品；不允许在作业区域吸烟、进食、随地吐痰及其它不卫生行为。
B.2.2 进入作业区域前应整理个人卫生，规范穿着洁净的工作服，头发应藏于工作帽内或使用发网约束； B.2.3 生产操作前按要求洗手、消毒；手工进行肉糜槌打时不允许脱衣操作；使用卫生间、接触可能污染食品的物品、或从事与食品生产无关的其他活动后，再次从事接触食品、食品工器具、食品设备等与食品生产相关的活动前应重新洗手消毒。 B.3 重点工序食品安全控制 B.3.1 原、辅料验收
B.3.1.1在接收或正式入库前必须经过对其卫生、质量的审查，查验供货者的许可证及产品合格证明，对名称、规格、数量、生产日期、保质期、供货者名称、地址、联系方式、卫生检验结果等进行登记后，方可入库；入库和使用应遵照“先进先出”或“效期先出”的原则。
B.3.1.2 采购原、辅料时，按该种原、辅料标准以及政府部门有关规定进行验收。应保证原、辅料具有该品种应有的色、香味和组织形态特征，不含有毒有害物质。应对供货厂家建立档案并对供应商能力进行评价，以便对产品进行全过程跟踪。 B.3.2 原、辅料及成品贮存
B.3.2.1牛源性肉类必须于0℃～4℃储存。
B.3.2.2 辅料冷藏库温度应控制在 0℃～10℃，冷冻库温度应控制在-18℃以下，应建立出入库台帐。 B.3.2.3 成品冷藏库温度应控制在 0℃～10℃，冷冻库温度应控制在-18℃以下，应建立出入库台帐。 B.3.3 原料处理
B.3.3.1 用清水清洗原料肉，采用人工或机械方式对大块原料分切至符合加工要求。 B.3.3.2 原料肉的分割过程应在低于 22℃的环境温度下进行。
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B.3.4 肉糜加工
B.3.4.1 应建立每批（日）原料肉的使用台帐，至少包括进货时间、来源、重量、检验、验收、操作者等信息。
B.3.4.2 严格按照产品的配料要求添加辅料，各功能区域不应出现与本产品无关的其它辅料、添加剂及非法添加物。应建立每批（日）配料使用台帐，至少包括配料名称、来源或产地、使用量（配比）、检验、验收、操作者等信息。
B.3.4.3 肉糜加工过程应在低于 22℃的环境温度下进行。 B.3.5 肉丸成型
B.3.5.1 手工挤丸操作者应穿着工作服和工作鞋（靴），佩戴帽子、口罩，并做好手部清洁、消毒；用手紧握肉浆控制大拇指和食指成环状并挤出肉丸，用羹匙掏进温水中定型。
B.3.5.2 机械成型设备应彻底清洗后方可开机使用；应做好防护，防止杂质等混入； B.3.5.3 根据产品工艺要求，肉丸成型应于45±5℃温水中进行。 B.3.6 肉丸煮制
根据产品工艺要求，肉丸煮制温度为92±5℃，煮制时间为20-30分钟，应由专人负责监控。 B.3.7 预冷
应在预冷区域进行预冷，预冷过程应防止产品再次污染，冷却后应立即进行包装。
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