实时荧光定量PCR实验操作步骤
以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提
①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度 成分
0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。 ③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。 ④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。 3样品cDNA合成 ①反应体系
序号 反应物 剂量 1 逆转录buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl
5 逆转录酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 总体积 10μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。 ③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。 ②反应体系如下： 标准品反应体系 序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 阳性模板上游引物F 0.5μl 3 阳性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl
6 阳性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。 管家基因反应体系： 序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 内参照上游引物F 0.5μl 3 内参照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl
6 待测样品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 总体积 50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。 5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 ①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。 反应体系：
序号 反应物 剂量
1 10× PCR缓冲液 2.5 ul 2 MgCl2 溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul
8 加水至总体积为 25ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72oC延伸5分钟。 ②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。 6 待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。 体系配置如下： 序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul 6 待测样品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul 8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。 7 实时定量PCR使用引物列表 引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
8 电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView?染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。 反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。 反转录反应条件如下。
37°C 15 min（反转录反应）
85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。 基因 引物序列 扩增片段长度 NR2B NR2B(+) CCGCAGCACTATTGAGAACA 213 bp NR2B(–) ATCCATGTGTAGCCGTAGCC 18s rRNA 18s TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA 198 bp rRNA(+) 18s CGTTTATGGTCGGAACTACGA rRNA(–) 1） 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。 试剂 使用量 终浓度 SYBRPremix Ex Taq（2×） ? TM12.5 μl 1× PCR Forward Primer（10 μM） PCR Reverse Primer（10 μM） 模板（cDNA溶液） dH2O 1 μl 0.4 μM 1 μl 0.4 μM 0.5 μl 10 μl Total 25 μl 全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。
2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。 PCR进行35个循环。
步骤 温度 时间
变性 退火 延伸
融解曲线 温度
95°C 55°C 95°C
95°C 58°C 72°C
30 秒 30 秒 30 秒
时间 0秒 15秒 0秒
变温速度 20°C/秒 20°C/秒 0.1°C/秒
PCR疑难解答
当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行： 1将PCR反应的试管与反应板紧贴。
2当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍3微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。 4不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。 5对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。 没有扩增产物：
1在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。 2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。
3检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。 4检查模板和引物的用量。
5增加循环次数和/或模板DNA的用量。 泳道中出现模糊条带：