表达谱基因芯片实验操作流程 一、试剂 1. TRIzol
2. 异丙醇 3. 氯仿
4. 75%乙醇（RNase-free） 5. Milli-Q水（RNase-free） 6. 无水乙醇 7. dNTPs
8. Cy5-dCTP和Cy3-dCTP 9. 杂交试剂1 10. 标记试剂I 11. 杂交试剂2 12. 标记试剂II 13. 反转录酶 14. 标记试剂III 15. 反转录引物 16. 洗片试剂1
17. 反转录酶缓冲液 18. 洗片试剂2 19. DTT
20. 洗片试剂3
*试剂7～20为产品芯片杂交试剂盒中的组分。 二、仪器与设备 1. 电动玻璃匀浆机 2. 电子天平
3. 低温高速离心机 4. 低温高速台式离心机 5. 超净工作台 6. 制冰机
7. 电热恒温水槽 8. 电泳槽 9. 电泳仪 10. 微波炉 11. 凝胶成像仪 12. 台式离心机 13. 核酸定量分析仪
14. 移液枪 15. 可调电炉 16. 旋涡混合器 17. 杂交箱 18. 杂交舱
19. S-200纯化柱 20. 真空浓缩仪 21. 盖玻片 22. 芯片扫描仪 三、总RNA提取
1)将超低温保存的样品除去样品袋，在电子天平上称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状。
2)将碾磨成粉末状的样品，转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中，在组织匀浆粉碎机上进行匀浆。匀浆至匀浆液不粘且无颗粒即可。
3)将匀浆液转移至15ml离心管中，于4℃，12000g，离心10min。 4)小心吸取上清液转入新的15ml离心管，在15～30℃放置5min。
5)向匀浆液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在15～30℃放置3min。
6)于4℃，12000g，离心15min。
7)从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一15ml离心管。
8)向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15～30℃放置10min。
9)于4℃，12000g，离心10min。
10)弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇5ml，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。
11)再加入75%乙醇10ml，在涡旋器上短暂涡旋；于4℃，8000g离心10min。 12)小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5min。
13)加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃保存。 四、探针标记与杂交 1、预杂交
1)配制预杂交液：杂交试剂1加入到的Eppenderf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2混匀。
2)将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2min，将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30sec，玻片取出后即放入无水乙醇中30sec，晾干。 3)将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5～6hr。
2、标记探针（以下在冰浴中进行）
1)于一已灭菌的1.5mlEppendorf管内依次加入以下试剂（反应终体积为50μl，以下试剂均为RNase-free）： ddH2O 23μl 逆转录引物5μl 总RNA50～100μg
振荡混匀，置于70℃水浴10min。取出后，迅速置于冰上。 2)分别加入以下试剂： 逆转录酶缓冲液10μl DTT5μl dNTPs4μl
3)而后在暗室中加入以下试剂： 逆转录酶2μl
Cy5-dCTP或Cy3-dCTP 3μl
4)用手指弹打管壁以混匀样品，手浴2min。将Eppendorf管置于42℃水浴2hr。
5)依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4μl，65℃水浴10min后加入标记试剂II 4μl。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50μl左右。 6)使用DNA纯化柱（或乙醇沉淀）纯化DNA。
7)将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头。
8)将柱置于一个1.5ml的Eppendorf管中，以3000rpm离心1min将柱置于另一个新的1.5ml Eppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间，注意不要搅动柱体。以3000rpm离心2min，经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。
9)加入标记试剂III 8μl，真空抽干。 3、杂交
1)在抽干的探针管中加6.5μl杂交试剂I，充分混匀，使探针溶解。再加入6.5μl杂交试剂II，混匀备用。
2)将预杂交的玻片取出，用ddH2O冲去盖玻片。
3)将探针置于95℃水浴中变性2min；玻片置于95℃水浴中变性30sec，玻片取出浸无水乙醇30sec，探针取出后迅速置于冰上。
4)将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42℃杂交箱内杂交过夜（16～18h）。 4、洗片
1)用0.5%的洗涤液1冲洗玻片，去除盖玻片。
2)准备两个染色缸，分别装有0.5%的洗片试剂1+2%的洗片试剂2、5%的洗片试剂3，放入60℃水浴锅中。
3)将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10min。 4)用0.5%的洗涤液1冲洗玻片，晾干后扫描。
基因芯片技术原理及其在表达谱中的应用 摘要：基因芯片（Gene chip），又称DNA芯片（DNA chip）或cDNA微矩阵（cDNA Micro
array），是利用光刻合成、高速打印或电定位等技术在硅、玻璃或尼龙膜上按照特定的排列方式固定有大量的基因探针（Gene probe），形成DNA微阵列。样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术摻入荧光标记分子与DNA微阵列杂交后，通过荧光扫描器及计算机分析，即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。该技术可应用于高通量基因表达平行分析，大规模基因发现及基因分析，基因多态性分析和基因组研究等,特别在表达谱中有重大应用价值。
关键词：基因芯片，微阵列，基因表达检测，DNA测序，人类基因组计划
随着人类基因组计划的顺利进行，预计到2003年人类可以完全测出自身的基因组序列。届时，人类将进入后基因组时代。探明人类全部基因的结构及其表达调控将成为后基因组时代的一个重要目标，而进行基因表达的检测则是研究基因功能的一个重要环节。传统的建立在电泳基础上的基因表达、序列测定、突变和多态性检测等研究方法，如PAGE、mRNADD和RDA等，不仅费时、费力、费钱，且不利于自动化；而DNA芯片技术结合人类基因组计划提供的大量信息，使得我们能够在全部基因组水平上对上述问题进行研究，其精细度可达到单个细胞中的一个拷贝。因此有人说今后基因组研究的大部分工作将在缩微芯片实验室（Laboratory on a chip）完成。
DNA芯片是生物芯片（Biochip）的一种。微阵列包括上万种寡核苷酸或DNA样品，密集排列在硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等固相支持物上。通过激光共聚焦荧光显微镜获取信息，经电脑系统处理，分析所得资料。一次微排列实验可对上千种基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确的检测。 1. DNA芯片技术的基本原理
DNA芯片实质上就是在芯片上按照特定的排列方式固定上大量的探针，形成一种DNA微矩阵，将样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子后，与位于芯片上的探针杂交，最后通过荧光扫描仪及计算机进行综合分析后，即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。其中制备芯片的材料通常是硅片、玻片、或者是尼龙膜；探针可以是寡核苷酸或cDNA，视用途而定。 1-1 基因芯片的制备
芯片种类较多，制备方法基本上可分为两大类：一类是原位合成；一种是直接点样。原位合成，是指直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针；而直接点样，是指将已经合成好的探针定位在芯片上。 1-2 样品制备、杂交和检测
待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法也各异。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。杂交条件的选择与研究目的有关。多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸即可。表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。