油菜素甾醇信号转导：从受体激酶到转录因子
Tae-Wuk Kim & Zhi-Yong Wang（王志勇） 斯坦福大学生物系、卡内基科学研究院
翻译：蒋建军、程鳞， 复旦大学遗传工程国家重点实验室
Annu. Rev. Plant Biol. 2010. 61:23.1–23.24 DOI:10.1146/annurev.arplant.043008.092057
关键词：拟南芥，GSK3激酶，植物激素，受体激酶，信号转导，甾体激素 摘要：
油菜素甾醇（brassinosteroids，BRs）是植物中一种促进生长的甾体激素。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中进行的遗传学研究揭示了BR在发育过程中的基础地位，并帮助鉴定出了与BR信号途径和生物合成相关的基因。最近，蛋白组学研究鉴 定出了缺失的环节。这样，这些方法就建立起了BR的信号转导级联反应途径，包括BR的细胞表面受体激酶BRI1感知BR、BRI1/BAK1激酶复合物的转磷酸化激活、BSK激酶磷酸化、BSU1磷酸酶激活、
BIN2激酶的去磷酸化和失活和非磷酸化状态转录因子BZR在细胞核内的积累。质谱分析给信号传递中每一步相关的磷酸化过程提供了详尽的信息。这样，BR信号途径就给出了理解受体激酶介导的信号转导的范式，也为作物提高产量的遗传改良提供了工具。
简介：
甾体长期以来被当做是多细胞动物的激素（85），直到30年前，植物中甾体分子的激素活性才被发现——一种从油菜（Brassica napus）花粉中提取的促进生长的物质鉴定为甾体化合物，并命名为油菜素内酯（brassinolide，BL）（24）。从此以后，具有与BL相似结构和活性的甾体分子不断被发现，统称为油菜素甾醇（brassinosteroids，BRs）（13）。虽然外源BR处理能够引发多种生理和发育上的反应，但是直到在油菜的近亲——模式生物拟南芥（Arabidopsis thaliana）——中鉴定出BR确实和BR不敏感突变体以后，BR在发育中的功能才被大量发现（12，49，81）。这些突变体表现出了许多生长缺陷，包括矮小、叶暗绿、开花延迟、雄性不育和全黑暗情况下的光形态建成。现在BR已被当做是广泛调控发育过程和生理过程如细胞伸长、维管分化、根生长、对光的反应、抗逆、衰老等的基本激素之一。
找到的这些拟南芥突变体不仅包括BR生物合成酶的突变，也有感知和传导BR信号的信号蛋白的突变。正向遗传学筛选鉴定出了多个等位基因中2个位点对BR不敏感的突变体 bri1和bin2. BR INSENSITIVE 1 (BRI1) 编码的蛋白属于拟南芥中富亮氨酸重复受体样激酶（LRR-RLK）家族，是其中超过200个成员中的一个（79）；BR INSENSITIVE 2 (BIN2) 编码的蛋白是拟南芥糖原合酶激酶3（GSK3）样激酶家族10个成员中的一个（50）。使用BR合成抑制剂油菜素唑（BRZ）或者是用bri1弱突变做遗传背景材料进行的敏感性遗传筛选鉴定出了信号途径的其他组分，包括转录因子BZR1（BRASSINAZOLE RESISTANT 1）和BES1（bri1-EMSSUPPRESSOR 1）（93, 97），BRI1相关受体激酶BAK1（BRI1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1）（52, 60），蛋白磷酸酶BSU1（bri1- SUPPRESSOR 1）（57）（图1）。BES1序列与BZR1有89%的相似度，因此也被称为BZR2（93）。BAK1是通过酵母双杂交筛选BRI1互作蛋白而鉴定出来的（60）。
BR信号途径的其他组分是通过筛选以上这些明确的组分的互作蛋白而发现的。BRI1的互作蛋白包括BAK1（60）、BKI1（BRI1 KINASE INHIBITOR 1）（89）、TTL （TRANSTHYRETIN-LIKE）（61）。14-3-3蛋白是筛选BZR1和BES1/BZR2的互作蛋白而
1
鉴定出来的（21，70）。此外，有证据显示BES1/BZR2可以与其他的转录因子如BIM1、ELF6和Myb30相互作用（53，96，98）。蛋白组学研究鉴定出了信号途径确实的最后一环（84），并且生物化学研究将这些组分整合起来，形成了一条连接从BR在细胞表面的感知到细胞核转录因子激活的磷酸化级联反应（42）。通过这些已知的过程，深入的生物化学研究揭示了受体激酶激活（91，92）、信号传递、磷酸化调控转录因子BZR（21，70，86）的分子机制。最近的一篇综述（87）讲述了BR通过BZR调控基因表达的内容，本文将集中在BR信号时如何从细胞表面受体激酶传递到细胞核内转录因子的。
受体激活：
BRI1在细胞表面感知BR
BR不敏感突变体bri1 (brassinosteroid insenstitive 1)是用外源BR处理后仍保持矮小的不敏感状态而鉴定出来的（12，40）。bri1的其他等位突变体促使了BRI1基因（编码LRR-RTK蛋白）的克隆（47）。BRI1的胞外域包含了24个富亮氨酸重复序列（LRR）和一个位于第20和21个LRR之间的“岛”区域（ID）；胞内结构域包括一个Ser/Thr激酶结构域、一个近膜区（JM）和一个C末端序列（47，87）。
几组实验证明BRI1的功能是作为BR的受体。这些实验包括：嵌合受体BRI1-XA21能在BR诱导下引发防御反应（29）、拟南芥内源（94）的或者大肠杆菌表达纯化的（43）BRI1能与氚标记BL（3H-BL）免疫共沉淀结合、BR能诱导BRI1的自磷酸化（90，91，94）。更深入的研究显示，含94个氨基酸残基的ID-LRR21结构域（包括岛区域ID和紧挨着ID的LRR21）是BR结合的充分条件（43）。这些研究就证明BRI1是BR受体，并给出了一种新的甾体结合基序。BR结合到BRI1的胞外域后，激活胞内激酶，进而将信号传递到胞内其它蛋白分子。
28个bri1位点突变的大部分都位于ID-LRR21或胞内激酶结构域，这与BRI1的BR结合和激酶活性的基本功能相吻合。有趣的是，一些胞外域的突变如bri1-5、bri1-9能因突变蛋白的错误折叠而将这些蛋白滞留在内质网中。遗传筛选这些突变位点的抑制子鉴定出了几个内质网质量控制系统中滞留和处理错误折叠的bri1蛋白的组分（34，37）。
结构域-结构分析也揭示了JM和CT结构域的重要作用。去掉JM结构域能消除BRI1的信号功能，这暗示JM在BRI1的功能发挥中起着正调控作用。相反，去掉BRI1碳末端49个氨基酸残基后，在体外实验中激酶活性更高，转基因到bri1突变体植物后挽救bri1表型更强，这暗示CT起着自抑制的作用（92）。CT区包含很多磷酸化位点，将这些Ser/Thr位点突变为模拟磷酸化的酸性氨基酸后的效应与去掉这个区域的效应相似，暗示CT区域的磷酸化能帮助激活激酶。这可能是通过C末端尾巴通过构象改变而释放自抑制功能而发生的（92）。
BR增加BRI1与其共受体BAK1异源寡聚化，诱导受体激酶二聚体化和寡聚体化 动物中的许多研究显示，受体激酶的激活通常需要配体诱导的同源或异源二聚体化，或着异源寡聚体化（67，74）。例如，感知TGFβ需要一个同源二聚体化得I型TGFβ受体和一个同源二聚体化的II型TGFβ受体。TGFβ结合到II型受体后，促进其与I型受体结合并磷酸化，进而将信号传递到下游组分。与此相似，BR信号转导也需要配体诱导的BRI1同源二聚体化或同源寡聚体化，还需要其与共受体BAK1（BRI1-Associated Kinase 1）异源寡聚体化。
BRI1的同源二聚体化最早是通过对豌豆原生质体的质膜进行荧光能量转移共振实验（FRET） 而检测到的（69）。在此之后，单分子检测技术证明质膜中大约20%的BRI1分子是以同源二聚体形式存在的，并没有更加高级的寡聚体化（31）。 拟南芥转基因植株中
2
BRI1-GFP和BRI1-FLAG融合蛋白的免疫共沉淀实验也检测到了BRI1的同源二聚体化。尽管在原生质体中，BR对BRI1的同源二聚体化几乎没有作用（31），但BR处理拟南芥植物后，BRI1-GFP和BRI1-FLAG的免疫共沉淀增加了，这就暗示BR能促进或者是稳定BRI1的同源二聚体化（92）。目前尚不清楚BR是像生长素诱导TIR1-IAA的二聚体化一样（82），作为分子胶水来帮助稳定BRI1同源二聚体；还是BR结合后引起构象变化成为更加偏爱同源二聚体的形式。据估算，每一分子BL能结合一个分子的BRI1-GFP（43），这就支持了第二种可能性。目前也不是很清楚BRI1激酶活性对BR诱导的BRI1同源二聚体化是否是必要的。不管怎样，BR诱导的BRI1同源二聚体化并不足以完全激活BRI1激酶，还需要共受体激酶BAK1的结合。
BAK1是由两个独立的研究小组分别采用酵母双杂交的方法筛选BRI1互作蛋白和激活标签（activation-tagging）筛选bri1-5抑制蛋白的方法鉴定到的（52，60）。BAK1也叫SERK3，是SERK家族（SERK1-SERK5）五个成员中的一个（75）。它也是LRR-RTKs，包含有一个具有5个富亮氨酸重复的小胞外域（图１）。过表达BAK1能抑制bri1弱突变体的表型（52，60）。bak1功能缺失突变体表型与bri1弱突变体类似（52），并且过表达激酶功能缺失的bak1突变体具有强烈的矮化表型，与bri1强突变体类似，推测这是由于显性抑制（dominant negative）效应的结果（52）。最近的BAK1/SERK3及其同源蛋白（SERK1和SERK4）的功能缺失遗传学研究阐明了他们在BR信号中的重要作用，与在其他通路中一样（3，28）。
在体外实验和酵母实验中，BRI1和BAK1的激酶结构域能相互作用并转磷酸化（52，60），并且他们的体内相互作用已经通过转基因拟南芥的免疫共沉淀实验和原生质体的荧光能量转移共振实验证实（52，60，69）。BRI1和BAK1在体外实验中，都有本底（basal level）激酶活性，相互由对方作用后迅速增加（52）。在酵母中，只有野生型BRI1和BAK1共表达的时候才能检测到激酶活性，突变或者缺失BRI1或BAK1都不能检测到（60）。这些结果暗示，BRI1和BAK1受体激酶活性的完全激活需要相互之间的转磷酸化。
在拟南芥中，BR处理能促进BRI1和BAK1的相互作用并增加它们的磷酸化水平（90，91）。BR诱导的BRI1-BAK1结合似乎是由它们的激酶结构域介导，而不是胞外域的共同结合。首先，BR结合BRI1并不依赖于BAK1，BAK1也不参与BR与BRI1的结合，在bak1无义突变体和BAK1过表达的植株中，BL结合BRI1的活性都没有发生变化（43，92）。其次，BRI1与BAK1的相互作用依赖于它们的激酶活性。将BAK1的激酶结构域突变后，体外相互作用减弱；BRI1的激酶结构域突变为没有激酶活性形式后，它们的相互作用几乎完全消失（52）。一个BRI1激酶活性丧失（kinase-dead）的突变体不能表现出BR诱导的与BAK1的结合，这暗示对于BR诱导的BRI1与BAK1的结合，完整的胞外域并不是充分条件，而BRI1激酶活性却是必要条件（91）。然而，酵母中BAK1胞外域亮氨酸拉链中的L46E突变似乎丢失了BAK1与BRI1的结合（99）。虽然这个结果可能支持了胞外域在BRI1-BAK1结合中的作用，但缺乏与BRI1的相互作用也可能是由于突变BAK1蛋白的定位错误（如滞留在内质网中）或在细胞中的不稳定性。另一方面，一个BAK1激酶活性丧失的突变体在BR处理后仍能与野生型BRI1结合，这暗示BR首先激活BRI1激酶，BAK1与BRI1的结合是第一步BRI1激酶激活的结果（91）。BRI1激酶活性的对于与BAK1相互作用和BAK1的激活的必要性也与一个观察到的现象一致，即BAK1过表达只能抑制bri1弱突变的表型，而不能抑制bri1-5 det2双突变和bri1无义突变的表型（52，60）。以上这些结果显示，BAK1参与BRI1的激活，不参与将BR信号传递到下游物质。
3
图1：BRI1和BAK1的结构。BRI1由24个富亮氨酸重复LRR、1个含70个氨基酸 的岛区域ID、单跨膜区TM、近膜区JM、激酶结构域KD和C末端尾巴CT组成。BAK1 由4个亮氨酸拉链LZ、5个LRR、1个富脯氨酸区、单跨膜区TM、激酶结构域KD 和一个CT组成。黑色方框表示推测的信号肽序列，灰色方框表示未知的区域。AL 表示激酶结构域的激发环。圆圈表示得到证实的磷酸化位点，带方框的P表示推 测的磷酸化位点。激活型磷酸化位点用红色表示，抑制性磷酸化位点用蓝色表示， 对激酶活性没有明显效应或者没有得到实验验证的用黄色表示。
受体激酶的团体行动和多重任务处理 BRI1是高等植物中主要的BR受体。番茄、水稻和豌豆中BRI1的直向同源物（ortholog）突变能引起BR不敏感的表型（55，59，62）。然而，BRI1并不是唯一的BR受体。拟南芥中有3个很接近于BRI1的同源蛋白，其中至少2个——BRL1和BRL3——能高亲和地结合BR。并且，以BRI1启动子表达这两个蛋白后，能挽救bri1突变体的表型（8，43，101）。这些BRI1同源蛋白似乎能介导维管组织中细胞类型特异（cell-type-specific）的BR反应（8）。
4
这种BRI1同源蛋白的功能特化在进化中显然是在单子叶植物和双子叶植物分化之前形成的，因为水稻的OsBRL1和OsBRL3也能介导组织特异的和细胞类型特异的BR反应（59）。
BAK1也属于RLKs家族中的SERK亚家族（SERK1-SERK5）。除了BAK1（SERK3），2个SERK家族的其他成员——SERK1和BKK1（BAK1-like 1，SERK4）——似乎在BR信号中起着和BAK1冗余的作用。和BAK1一样，过表达SERK1或BKK1都能部分抑制bri1-5的表型；体内实验中，它们也能与BRI1相互作用（3，28，38，69）。虽然bak1功能确实单突变只有比较弱的矮化表型，但bak1 serk1-1双突变的BR不敏感的矮化表型显著增强，bak1-4 bkk1-1双突变和bak1单突变相比，只有去黄化轻微增强的表型。最近有人提出，SERK1和BAK1/SERK3一起，而不是和BKK1/SERK4一起，介导对BR的响应（3）。然而，bak1 serk1双突变体的表型仍然比bri1强突变体和表达显性抑制形式bak1的转基因植株的表型弱得多（52）。加上BAK1和BKK1在抑制细胞死亡的信号通路中的作用，分析起来会更加复杂。
遗传学研究也发现了BAK1和SERK家族其他成员在多个信号通路中的作用。首先，BAK1和BKK1/SERK4参与控制光依赖性细胞死亡过程（27）。bak1 bkk1双突变体表现出光下的幼苗致死表型，但在暗处却没有。在bak1 bkk1双突变中能观察到细胞死亡表型的多个方面，包括防御相关基因的上调和胼胝质、H2O2的积累，但在每个基因的单突变和bri1无义突变体重却没有这种现象。这就暗示BAK1和BKK1在抑制不依赖于BR信号的细胞死亡通路中起着冗余的作用（28）。其次，BAK1在病原菌感染后的植物发病过程中起着非常重要的作用。bak1突变体对腐殖营养病原菌感染（necrotrophic）表现出更强的易感性（41）。用BR处理后，只能抑制bak1的生长缺陷表现，而不能抑制他的疾病易感表型，这就支持了BAK1在防御中不依赖于BR的假设（41）。另外，bak1突变体对病原菌相关分子模式（PAMPs）如鞭毛蛋白（flagellin）、EF-Tu、INF1和CSP22表现出敏感性降低。更加深入的研究显示，用鞭毛蛋白处理后，BAK1能与鞭毛蛋白受体FLS2（也是一种LRR-RTK）相互作用（10）。这些结果显示BAK1在鞭毛蛋白信号途径中能作为FLS2的共受体。Shan及其同事报道了细菌性病原菌的毒性因子（virulence factor）能与targetBAK1以战胜寄主防御系统，同时抑制BR信号通路（78）。过表达细菌效应蛋白AvrPto的转基因植物具有与bri1弱突变体相似的矮小表型，AvrPto和AvrPtoB也能与BAK1相互作用，导致FLS2-BAK1结合的瓦解（78）。再次，SERK1和SERK2在雄性孢子发生中起着冗余作用。serk1 serk2双突变因为花粉绒毡层发育缺陷而雄性不育（2，14）。
综合起来，SERK家族的四个成员似乎在4个不同的途径中起着相互重叠的作用：BAK1、SERK1和BKK1/SERK4在BR信号通路中起作用；BAK1和BKK1/SERK4在细胞死亡控制中起作用；BAK1在鞭毛蛋白信号途径和自然免疫中起作用；SERK1和SERK2在雄性孢子发生中起作用（3）。一个基因家族的成员可能是通过基因duplication产生的，这样最早得到的基因拷贝功能上就是完全冗余的。SERK家族不同成员是如何获得并保持自身特定的功能的在进化上是一个有趣的问题。功能上的特异性或许是由启动子和编码序列的改变而产生的，结果就导致了多种多样的组织特异性基因表达和蛋白活性。用SERK1或SERK2的启动子驱动SERK3的表达并不能拯救serk1 serk2双突变体的雄性不育表型，这说明SERK蛋白功能是特异的（3）。相反，BRI1同源蛋白的功能特异性是通过启动子改变和基因表达模式改变而获得的，因为用BRI1启动子驱动表达BRL1也能拯救bri1的表型（8）。
番茄BRI1的双重功能是值得注意的，即还能与系统素（systemin，一种对受伤反应的肽类激素）结合（72，73），然而，这项发现之后受到争议（32，33，55）。近期的研究发现得出结论：番茄BRI1对于BR信号是必需的，但对于系统素的信号不是必需的（33，55）。与此类似，孕酮被发现能与一些动物细胞中的催产素的G蛋白偶联受体结合（23），但这些结果也是随后颇受争议（4，7）。
5