通过自磷酸化和转磷酸化调控
为了了解BRI1和BAK1的信号机制，最新的几项的研究主要通过质谱（MS）鉴定出了它们激酶结构域的磷酸化位点（39，64，90，91，99）（图1）。体外的磷酸化位点鉴定是通过分析大肠杆菌表达并纯化的重组胞内结构域实现的，而体内磷酸化位点鉴定是通过分析免疫共沉淀的转基因拟南芥的表位标记BRI1或BAK1而实现的。这些研究明确鉴定出了11个BRI1中的磷酸化位点（6个是体内磷酸化位点，5个只在体外磷酸化）。质谱数据也说明存在不属于特定氨基酸残基的其他磷酸化位点，包括存在于第VII和第VIII结构域之间激发环上的至少3个位点。此外，磷酸肽作图（phosphopeptide mapping）之后进行的定点突变证明其他位点存在磷酸化（S1162）（92）。尽管最初的质谱数据只鉴定出了Ser/Thr残基的磷酸化，最近的一项采用磷酸肽特异性抗体和质谱分析的研究为BRI1的Tyr残基在体内和体外都能磷酸化给出了令人信服的证据（64），这暗示BRI1是一个双重特异性激酶。有趣的是，许多其它LRR-RTK，如BAK1和BKK1，也能在Tyr位点发生磷酸化（64）。
许多鉴定出的或推测出的BRI1磷酸化位点的功能已经通过定点突变后的体外激酶实验和bri1表型挽救实验得到了研究（64，90，91）。这些研究证明BRI1激发环的磷酸化对于激酶活性具有及其重要的作用。体外实验中，S1044/T1045、T1049、Y1052、Y1057突变的BRI1几乎完全丧失激酶活性，并且不能挽救bri1-5的表型。两个激发环外的Tyr位点突变（Y956和Y1072）也失去了激酶活性，尽管在体内还没有检测到Y1072的磷酸化。
BRI1的JM区和C末端结构域磷酸化的重要作用也被证明了。去除JM区后，BRI1不能发挥信号作用和拯救bri1-5突变体表型，并且没有影响BRI1在质膜上的定位（92）。通过质谱分析，鉴定出了JM区的7个磷酸化位点，它们在体内和体外实验中能自我磷酸化（63，90）。其中，四个磷酸化位点的模拟磷酸化替代（S838D、T842D、T846D和S858D）在没有BAK1的情况下增强了BRI1自身的磷酸化，说明JM区的磷酸化激活了BRI1（91）。然而，JM区调制BRI1活性的激活机制目前仍不清楚。
与JM相反，在体外实验和体内实验中，去除CT区域的BRI1能增加BRI1的激酶活性，且比野生型BRI1更加有效促进地bri1-5和det2突变体的下胚轴生长（92）。CT尾巴的多个Ser/Thr位点都是磷酸化的，其中8个可能的位点中的4个（S-1162、S-1166、S-1168和T-1180）已经被实验证实（90-92）。将CT的多个Ser/Thr残基替换成Asp后能显著增加BRI1不依赖于BAK1的激酶活性（91）。此外，将CT尾巴包含模拟磷酸化突变位点的BRI1突变体能更加有效抑制det2的矮化表型缺陷（91,92）。这些研究结果说明，BRI1的CT尾巴是其激酶结构域的自抑制区，磷酸化可以减轻抑制效应（92）。BRI1的JM区和CT尾巴的功能说明，胞内域的非催化部分在特异性调节激酶的活性中起着重要作用。哺乳动物受体激酶胞内非激酶结构域不仅在自调节中起重要作用，也为底物创造结合位点，而这些作用是依赖于磷酸化状况的（35,36）。同样，BRI1的JM区和CT尾巴也可能参与调节激酶活性，并能为BRI1下游底物创造结合位点。
目前已经鉴定出了BAK1胞内域的9个磷酸化位点，其中5个（S290,T312,T446,T449, T455）在体内磷酸化，4个在体外（S286,T450,S604,S612）（31,91,92,99）。和BRI1不同的是，BAK1的磷酸化主要发生在激发环（T446,T449,T450,T455）上（91），不过最近在体外也鉴定到了CT尾巴上的2个磷酸化位点（S604，S612）（39）。BAK1激发环上对应于BRI1 T1049的T455残基的磷酸化在其功能发挥中是必需的，因为将T455突变为A以后，激酶活性丧失（91）。尽管激发环上其他磷酸化位点的单突变对BAK1的活性没什么影响，但将所有3个Thr突变为Ala（T446A/T449A/T450A）后激酶活性也会丧失（91，99），预示激发环的磷酸化对BAK1的激酶活性至关重要。
虽然分析体外自磷酸化位点和体内磷酸化位点已经阐明了其磷酸化状态能影响激酶活性和信号功能的重要氨基酸残基，但BR调控这些位点磷酸化过程的机制仍然不清楚。最近，
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有人提出BR诱导的BRI1和BAK1的结合是BRI1激酶第一步激活的结果（91），接下来BRI1和BAK1相互转磷酸化，进而激活这两个受体激酶。
BR诱导的BRI1和BAK1的结合依赖于BRI1的激酶活性而非BAK1，因为BR能增加野生型BRI1和激酶活性丧失BAK1的互作，但不能增加突变体BRI1和野生型BAK1的互作。尽管突变体BRI1仍然能与BAK1有基底水平的互作，但其不能由BR处理而增加（91）。此外，BRI1过表达能增强BR诱导的BAK1磷酸化，但在bri1无义突变体中没有此效应。相反，在bak1 bkk1（serk3 serk4）双突变背景下，BR处理仍能诱导BRI1磷酸化，虽然和在野生型背景和BAK1过表达背景下的相比，其磷酸化水平要低一些。体外实验中，BAK1对BRI1的预磷酸化增加了BRI1对底物特异的磷酸化水平，暗示BRI1具有能被BAK1转磷酸化显著增强的基底水平磷酸化（91）。此外，过表达BRI1能拯救bak1 bkk1双突变体的下胚轴伸长表型，而过表达BAK1却不能抑制bri1无义突变体的表型缺陷（91）。然而，在bak1 bkk1双突变体内SERK1可能仍有功能，因为它也能与BRI1结合并对BR信号起作用（3,38）。这样，为了了解BAK1及相关蛋白是否在BR诱导的BRI1激活中起着必要性的作用还是支持性作用，还需要研究bak1 bkk1 serk1无义三突变体。
BRI1和BAK1的相互激活由转磷酸化介导。通过以一个激酶失活蛋白作为另一个野生型蛋白的底物的体外激酶实验，已经鉴定出了转磷酸化的位点。质谱（MS）数据显示BRI1主要磷酸化BAK1的激酶结构域。有6个BAK1残基能被BRI1磷酸化（S290，T312，T446，T449，T450，T455），其中的4个Thr残基（T446，T449，T450，T455）位于激发环，对于BAK1的激酶活性和信号功能是必需的（91）。将T455突变为Ala，或者将T446、T449、T450全部突变为Ala后，BAK1的活性均会丧失（91,99）。所以，BAK1磷酸化这些残基后，可能就激活了BAK1。
与BRI1磷酸化BAK1的激发环不同，BAK1主要磷酸化BRI1的JM区和CT尾巴（91）。已经鉴定出BAK1转磷酸化BRI1的位点是JM区的3个残基（S838,T846,S858）和CT尾巴的2个残基（S1166,T1180）。此外，JM和CT的模拟磷酸化突变体的BRI1激酶活性增强（91）；且JM区Ser/Thr替换为Ala后的bri1突变体在抑制bri1-5的短下胚轴表型缺陷上，比野生型BRI1更弱。这些结果就支持BAK1通过磷酸化JM和CT结构域来激活BRI1的假说（91）。综合起来，这些结果也就支持了一个BR激活BRI1-BAK1受体激酶的顺序磷酸化模型：BR结合诱导BRI1激酶的基底水平激活，然后BRI1与BAK1结合并磷酸化BAK1的激发环从而激活BAK1；激活的BAK1磷酸化BRI1的JM和CT而完全激活BRI1的激酶活性，通过增强BRI1磷酸化下游底物的能力实现其信号功能。
虽然磷酸化大多数位点都能激活激酶活性，但突变研究也找到了一些磷酸化能抑制激酶活性的位点。BRI1的T872A突变能增强激酶活性十几倍：其Vmax增加且Km减小。这说明T872的磷酸化具有负调控激酶活性的作用，不过也有可能是因为将这个Thr替换为Ala后，蛋白构象改变成了更有活性的状态（90）。另外，BAK1的S286D突变在体外和体内实验中能使BAK1失活，但S286A却没有什么作用（91）。在体外检测到S286是作为BAK1的自磷酸化位点。目前仍不清楚的是，BAK1的S286在体内的自磷酸化是一种脱敏机制，还是一种其他激酶调控BAK1活性的机制（91）。
一些磷酸化位点除了影响激酶活性，似乎也能介导特异性的信号输出。BRI1中JM区的Y831F突变对激酶活性没有明显影响，但表达Y831F突变的BRI1却能拯救bri1-5的生长表型缺陷，导致叶片更大、开花提前。这就意味着Y831的磷酸化可能对叶片发育和调控开花具有信号输出功能。此外，包含激发环上T450A突变的BAK1表达也能拯救bak1 bkk1双突变的细胞死亡和矮化表型缺陷，但不能拯救其鞭毛蛋白不敏感表型（91）。以上结果说明，个别磷酸化位点可能影响特异性的信号输出。
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BRI1和BKI1的内吞 在哺乳动物和酵母中，内吞是将激活的受体从质膜传递到下游靶标、将受体从细胞表面清除以终止信号和使系统脱敏的普遍机制（30，56）。最早研究人员在豌豆原生质体中观察到了BRI1和BAK1的内吞（69），且在原生质体中共表达BRI1和BAK1能加速内吞。最近，在拟南芥根细胞核内体（ednosome）中观察到了不依赖于BR处理的BRI1-GFP（22）。一种阻止从初级核内体向次级成熟核内体的抑制剂Brefeldin A（BFA）能诱导BRI1-GFP在核内体小泡中的积累。有趣的是，BFA处理能激活BR信号，引起BZR2/BES1的去磷酸化和抑制DWF4的表达（22）。相反，一种影响PM/核内体间运输的化学物质Endosidin 1能使BRI1-GFP在大的胞内体（large intracellular bodies）中积累（68），并有与bri1相似的矮化表型。BRI1的内吞似乎不受BR调控，但在原生质体中过表达BAK1能使其增强。
SERK1也是向胞内运输的，其内运与激酶相关的蛋白磷酸酶相关（KAPP）（77）。KAPP具有一个磷酸化肽结合结构域（FHA），并依赖于激酶活性而于SERK1互作。共表达KAPP能增强SERK1的内运。尽管KAPP和SERK1都定位于细胞膜，但FRET检测发现，其生理互作只发生于胞内小泡（vesicles）中。这样，就有KAPP控制SERK1 内运的假说（77）。KAPP也能依赖于磷酸化状态而与BRI1和BAK1互作（17），其不能与激酶活性丧失的mBRI1（K911E）和mBAK1（T546A）互作。kapp bri1-5双突变对BL的敏感性比bri1-5单突变更强，这预示KAPP可能是一个BR信号途径的负调控原件（17）。KAPP究竟是通过去磷酸化受体激酶抑制BR信号，还是通过促进内吞而抑制BR信号的尚需进一步研究。
虽然这些研究说明了BRI1的正确定位对于其信号功能的重要性，但BRI1内吞的功能尚未知晓。基于BFA敏感的核内体BRI1对信号的正作用，有人提出内吞对与胞内蛋白互作提供了额外的表面空间和可接近性，或者是小泡包围并捕获受体-配体复合物以维持BR的信号（22）。在根中，后一种假说或许更加重要，因为水能洗脱掉胞外的信号分子。在拟南芥中，BRI1定位于大多数细胞的质膜上，而核内体 BRI1只是在根细胞中观测到（20,22）。另一方面，我们仍不知道BRI1如何从细胞表面去除，比如说在停止生长的成熟组织中（20）。我们也不知道BRI1的内运是否像动物系统的一些受体一样，是参与受体降解的一种方式（30）。
通过BKI1调控
BRI1/BAK1受体的活性也受其他互作蛋白的调控。除了BAK1，几个其他的新BRI1互作蛋白也通过酵母双杂交的方法鉴定出来了（61，89）。其中一个即是BKI1，它能够负调控BRI1的活性。RNAi减少BKI1量能增强下胚轴的伸长，而过表达BKI1导致弱的矮化表型。此外，BKI1过表达能减少BR处理诱导的BZR2/BES1去磷酸化，也能改变BR调控的基因表达水平，这说明BKI1是BR信号的负调控原件。没有BR的时候，BKI1定位于细胞膜，但经BR处理后，BKI1迅速从膜上解离而到细胞质中（89）。这些现象说明BKI1在细胞膜上与BRI1相互作用，使BRI1处于失活状态。BKI1抑制BRI1的部分原因也是阻止BRI1与BAK1的互作，因为在体外实验中，当与BKI1共培养后，BRI1与BAK1的互作减弱。一旦BR激活BRI1的激酶活性，BKI1即被BRI1磷酸化，并迅速与BRI1解离，使BAK1能与BRI1结合并完全激活BRI1（89）。为了支持这个假说，人工在BKI1的N末端加上豆蔻酰化（N-myristoylation）位点而强制使BKI1定位于质膜上，能增强BKI1过表达植物的矮化表型。这些结果说明，BKI1是当BR浓度低的时候使BRI1处于基底水平的另一种控制方式。
受体激酶的信号输出
BRI1-BAK1受体复合物的信号输出应该由这些激酶的胞内底物介导。出了BAK1和
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BKI1，还有一些其他的BRI1互作蛋白被鉴定出来，并且，至少咋体外实验中能被BRI1磷酸化。这些蛋白包括位于细胞膜上的TTL蛋白（TRANSTHYRETIN LIKE）、TGFβ受体互作蛋白TRIP-1的同源蛋白、BSKs（BRI1 Signaling Kinases）。
TTL在酵母中能与BRI1互作，在体外实验中能被BRI1磷酸化（61）。过表达TTL能引起与bri1弱突变体相似的矮化表型，ttl敲出突变体显示出更强的BR敏感性和生长表型，这说明TTL通过与BRI1激酶互作而负调控BR信号。TTL与激活的BRI1的结合比与激酶失活的BRI1更强（61）。这与BKI1恰好相反，因为BKI1与失活状态BRI1的结合更强（89）。基于TTL定位于质膜上，有人提出TTL可能直接介导BR调控的控制细胞伸长的细胞膜的活性（61）。目前还不知道TTL与BRI1的互作是否影响对BR相应的下游基因的表达。
TRIP-1与哺乳动物TGFβ受体互作蛋白序列相似。TGFβ受体互作蛋白在TGFβ信号途径中起重要作用，并且也是真核生物翻译起始因子eIF3的一个必需亚基。TRIP-1在体内实验和体外实验中，均能与BRI1互作；体内实验中，其至少有3个残基（T14，T89，T197或S198）能被BRI1磷酸化，暗示其为胞质内的BRI1激酶底物。有人提出TRIP-1可能在BR介导的翻译调控中起作用（18），然而还缺乏BR直接调控蛋白翻译的证据。最近，定量蛋白组学研究鉴定出了大量受BR调控的蛋白，但除了在翻译后磷酸化调控的BR信号原件以外，还没发现其他蛋白的蛋白水平和编码RNA水平的变化（16）。
通过二维差异凝胶电泳，对总蛋白的蛋白组学研究鉴定出了BR信号途径后期的响应原件蛋白，但进行磷酸化蛋白分析或质膜部分分析，鉴定出了介导早期BR信号转导的响应蛋白（83）。这包括BAK1和定位于质膜且只在BR处理后磷酸化的BR信号激酶BSK（BSK1、BSK2）（84）。BSKs属于含12个成员的RLCK XII亚家族，它们都包含有一个N末端激酶结构域和一个C末端tetratricopeptide基序。在拟南芥中，RLKs是一个拥有超过610个成员的大家族，其中25%是没有胞外域或跨膜区的RLCK（80）。在体外实验中，BSK1能被BRI1磷酸化，而不被BAK1磷酸化，且BRI1磷酸化BSK1的特定Ser残基（S230）。荧光免疫共沉淀检测到了BSKs与BRI1的体内相互作用，BR处理后，荧光免疫共沉淀的量减少，说明一旦磷酸化，BSKs与BRI1解离（84）。尽管大部分BSKs敲除突变体都没有明显表型，但bsk3敲除植物对BR的敏感性和对BR合成抑制剂BRZ的超敏感性减弱。在bri1-5中过表达BSKs能强烈抑制其矮化表型缺陷，使BR调控的基因表达恢复。此外，在bri1无义突变体中过表达BSKs能部分拯救表型，但不能拯救纯合bin2-1的表型，说明BSKs是位于BRI1下游、BIN2上游的正调控原件（84）。
BZR1和BZR2/BES1: BR调控基因表达的关键转录因子
遗传学研究鉴定出了2个同源的转录因子，它们是BR信号途径的关键组分。遗传学研究还证明BR调控植物发育是通过调制核基因的表达来实现的。抗油菜素唑突变体bzr1-1D突变体在没有BRZ和有BRZ的条件下像野生型，相反，野生型幼苗在BRZ条件下有去黄化表型（93）。bzr1-1D突变体能完全抑制bri1的去黄化表型，且能部分抑制其矮化表型。BZR1是拟南芥中一个植物特有基因家族5个成员中的一个（图2）。bzr1-1D中的P234L突变能稳定BZR1蛋白，引起黑暗条件下组成性BR相应生长（93）。在bes1-D（bri1-EMS-suppressor 1）突变体中也发现了BZR1最近的同源蛋白BZR2同一个位点的Pro到Leu的突变（BZR2氨基酸序列的88%与BZR1相同），因此，BZR1也叫BES1（97）。过表达BZR1能增加下胚轴长度，T-DNA插入敲除突变体bzr2-1下胚轴长度稍微减短（25,93）。此外，RNAi干扰抑制BZR2/BES1及其同源蛋白能引起矮化表型（96），暗示BZR1和BZR2/BES1是BR信号途径中具有冗余作用的正调控因子。
最近证明BZR1和BZR2/BES1是直接调控BR响应基因表达的转录因子（25,96）。在一组实验中，BZR1与GAL4 DNA结合结构域的融合蛋白能抑制含GAL4结合位点的启动
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子-报告基因的转录，说明BZR1具有抑制转录的活性。染色质免疫共沉淀实验（ChIP）证明BZR1与BR合成相关基因CPD和DWF4的启动子区域结合，BR处理后能以负反馈机制迅速抑制这种结合。一系列体外DNA结合实验说明BZR1通过其N末端直接与CPD启动子对BR相应必需的CGTGT/CG序列结合，这个序列也被称为BR相应原件（BRRE）。与BZR1通过BRRE抑制基因表达的结果一致，人们发现BRRE在大量的受BR抑制基因中含量丰富，包括一些BR生物合成基因。有趣的是，BRRE在BR诱导的基因中含量也稍显丰富。鉴于BZR1在BR合成反馈抑制和BR促进植物生长的过程中有着双重作用，推测BZR1可能通过与不同的元件互作来激活特定的启动子（25）。
与BZR1的转录抑制活性相比，BZR2/BES1能激活BR诱导的基因SAUR-AC1（96）。BZR2/BES1与bHLH转录因子BIM1结合后，一起与SAUR-AC1启动子的E盒（CANNTG）结合。Transient过表达BZR2/BES1和BIM1能激活SAUR-AC1启动子:GUS报告基因，说明BZR2/BES1和BIM1正调控SAUR-AC1的表达。虽然BIM1过表达和抑制表达实验都说明其在植物生长中起作用，但这些表型却很不明显（96）。可能原因是其他的bHLH蛋白具有冗余作用，或者是BIMs只控制一些特定的受BR调控的基因和发育过程。事实上，一项最新研究鉴定出了2个含Jumonji结构域的蛋白ELF6和REF6，他们也是BZR2/BES1互作蛋白。之前的研究发现这两个蛋白能调控开花（98）。此外，也有实验证明BIMs能与2个参与胚胎发育的AP2/ERF转录因子DORNROSCHEN和DORNROSCHEN-LIKE互作，且bim1突变体具有低外显率的胚胎发育缺陷（9）。这些结果说明BZR2/BES1通过募集其他转录调节因子来调制某部分靶基因的表达和特定的发育过程。
BZR1和BZR2/BES1相反的转录活性也为bzr1-1D和bes1-D突变体在光下表型的不同提供了可能的解释。这两种突变体都对BRZ不敏感、在暗光照条件下能抑制bri1的表型，但在光生长条件下表型相反，bzr1-1D是半矮化的，而bes1-D却有与BR处理植物相似的长叶柄和白化叶表型（93,97）。通过BR处理或者过表达BR合成基因能拯救bzr1-1D的表型，这至少部分是由过度反馈抑制BR的合成引起的（25）。相反的转录活性能够解释光生长突变体在细胞伸长上相反的效应。然而，这却与黑暗条件下和无BR条件下这些突变体具有相似的总体组成型BR相应的表型不一致。事实上，有研究显示BZR2/BES1也能介导CPD和DWF4的反馈抑制表达（57,87），BZR1也能介导BR诱导基因的激活（25）。考虑到BZR1和BZR2/BES1具有几乎一样的氨基酸序列，尤其是DNA结合结构域，有可能BZR1和BZR2/BES1具有相似的DNA结合和起始转录活性，只是它们在不同的组织表达，这样，对BR来源组织的BR合成和BR靶组织的细胞伸长就具有不同的效应。对BZR家族成员组织特异性表达的详细研究将揭开它们功能特化的谜团。此外，鉴定出BZR1和BZR2/BES1的所有靶基因对于理解BR信号途径的功能也是相当重要的。
图2： BZR1转录因子的结构。BZR1由一个富丙氨酸结构域AR、核定位序列NLS、DNA结合结构域 DB、BIN2磷酸化结构域、14-3-3结合基序和一个富PEST结构域组成。星号表示推测的 BIN2磷酸化位点，黄圈表示被BIN2体外磷酸化的位点，红圈表示被BIN2体内磷酸化的位点。 （修改自Ref.16,21;T-W. Kim和Z.Wang未发表数据）
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