BIN2介导的磷酸化调控BZR1和BES1/BZR2
作为BR信号途径的关键转录因子，BZR1和BES1/BZR2受上游元件严密控制。BR处理可诱导BZR1和BZR2的快速磷酸化，这个过程可以用免疫印迹方法检测到。结果显示，BZR1和BZR2应该是被一个负调控BR信号反应的激酶磷酸化，这个激酶即是BIN2。
bin2（又名dwf12或ucu1）是除bri1以外的另一个引起BR不敏感、矮小的植株表型的位点。跟bri1不同，bin2突变体是一个半显性功能获得性突变体（11,51,66）。BIN2蛋白与GSK3有70%的相似性。GSK3s在真核生物中，从酵母到人类，是保守的，并且在众多的信号通路中发挥重要的作用。与一般的负调节因子相同，BIN2的过表达能引起与bin2-1相似的矮小表型，而BIN2或其同源蛋白的功能缺失型突变体促进细胞的伸长，并且部分挽救bri1-5表型，都印证了BIN2在BR信号通路中的抑制功能。
若干证据都证明，BIN2通过磷酸化BZR1和BZR2来负调控BR信号途径。首先，bzr1-1D和bes1-D突变体都充分抑制bin2-1突变体表型，这就支持了在BR通路中BZR1和BZR2是BIN2的下游因子的说法（93,97）。其次，在酵母和在体外，BIN2都与BZR1,BZR2直接互作。第三，在体外BIN2能对BZR1和BZR2进行高效的磷酸化，BZR1和BZR2的这个转变这与BR处理后的转变相反。第四，在bin2-1突变体中，BZR1和BZR2的磷酸化以及累积水平受到抑制（93，97）。另外，用化学抑制剂，如LiCl和bikinin对BIN2进行抑制，会引起BZR1和BZR2的积累（15,95）。BZR1、BZR2和水稻的同源蛋白OsBZR1中有25个公认保守位点能被GSK3磷酸化，并且这些磷酸化位点似乎对转录因子有着不同的调控机制。
BIN2磷酸化对于BZR1和BZR2的功能有多重抑制作用。首先，被磷酸化的BZR1进入26S蛋白酶体介导的降解过程，因为用蛋白酶体抑制剂MG132处理后，磷酸化的BZR1水平升高，而未磷酸化水平不变。但是现有数据对于BR处理能否引起BZR2水平的升高存在自我矛盾（86,97），在bri1和bin2-1突变体中BZR2水平均显著收抑制（97）。其次，BZR1和BZR2的磷酸化抑制他们与DNA的结合活性。在体外BIN2-磷酸化BZR1复合体和BIN2-磷酸化BZR2都不能与从CPD或SAUR-AC1启动子得到的DNA片段结合，在BIN2存在情况下，酵母中的BZR2的转录活性也受到抑制（21,86），第三S173的磷酸化能与14-3-3结合，它们的结合抑制了BZR1和BZR2的细胞核定位（21）。
对于BR能否诱导BZR1和BZR2的细胞核定位尚有争议（21,86,93,97,100）。这个差异可能反应了在不同种类细胞或不同生长条件下的细胞的不同反应。例如，BR处理能快速提高刚出芽幼苗下胚轴中细胞核与细胞质的BZR1比例，但是在成熟幼苗中，这个反应就没有那么明显。亚细胞结构分离试验发现了磷酸化的BZR1能结合到质膜上，这说明磷酸化的BZR1能存在于细胞质中（21）。另外，在拟南芥和水稻中的研究均证实了14-3-3蛋白在磷酸化的BZR因子的细胞质定位过程中的重要作用。
酵母双杂交方法发现，拟南芥中14个14-3-3蛋白中的5个与BZR1互作，水稻中8个14-3-3蛋白均与OsBZR1互作（5,21）。14-3-3是能与磷酸化的堕胎结合的蛋白质，并且在所有真核生物中高度保守（6）。他们参与多种信号通路中，调控酵母和哺乳动物内的多种进程（6）。在植物中，14-3-3蛋白调控多种新陈代谢相关的酶，离子通道和激素反应如ABA和赤霉素（76）。14-3-3s与目标蛋白的特殊序列结合，这个过程依赖于目标蛋白的磷酸化。它能特异性识别两种序列：模式一，RXXpSXP，模式二，RXXXpSXP（X=任意氨基酸，R=精氨酸，pS=磷酸化的丝氨酸，P=脯氨酸）（1,58）。BZR1,BZR2和OsBZR1都包含一个保守的14-3-3结合模体（BZR1的169-175氨基酸序列：RISNSCP），其中BZR1所必须磷酸化的的S173在体外能被BIN2磷酸化（5，21）。BZR1的S173A突变和OsBZR1的S156A突变完全破坏了它们与14-3-3在体内和体外的结合。BZR1-S173A和OsBZR1-S156A在转基因拟南芥中的表达引起组成性BR反应表现型，与bzr1-1D突变体类似，这说明与14-3-3
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的结合抑制了BZR1的功能（5,21,70）这些突变蛋白在植物中似乎有正常的与DNA的结合功能，并且稳定性升高，但是它在细胞核的积累水平升高，细胞质内的水平却受到抑制（5,21,70）。另外，用14-3-3的抑制剂AICAR处理后，细胞核内的BZR1-YFP水平同样升高，并且使受BZR1基因下调的CPD和DWF4基因的表达受到抑制（21）。另外一个用原生质体系统研究的的实验同样证明BIN2介导的磷酸化能调节BZR1的细胞核-质之间的运输、14-3-3的结合区域和调控所需的其他磷酸化位点（70）。总起来说，这些研究都证明了BZR因子在细胞质中定位这一过程依赖于磷酸化，且由14-3-3介导，同时在BR信号通路中起着重要作用。14-3-3蛋白可能通过促进BZR1的核输出和细胞质的包容性来增加它在细胞质中的定位（21,70）。
拟南芥基因组中含有10个GSK3-like激酶，同样命名为AtSKs（Arabidopsis thaliana Shaggy-like Kinases），它们可分为四类。进来的研究证明其中属于第Ⅱ类得3个（AtSK21, AtSK22,AtSK23/BIN2）在BR信号中广泛发挥作用。它们的3重功能缺失型突变体表现出叶柄伸长，抗BRZ的表型。但是相当多的磷酸化状态的BZR2仍然存在于三重突变体中，表明可能还有其他AtSKs参与BR通路（86,95）。实际上，AtSKs家族的全部9个成员的酵母双杂交实验证明，所有属于Ⅰ类和Ⅱ类的6个AtSKs均能与BZR1结合（42）。对于家族Ⅰ成员之一的AtSD12深入研究证明，它在体内能与BZR1互作，在体外能磷酸化BZR1，在BR处理后失活（42）。所以，至少有6个AtSKs在BR信号通路中发挥负调控作用。
除了BZR1和BZR2，BIN2还能磷酸化ARF2转录因子（88）。ARF2是一个转录抑制子，对BR和生长素反应起负调控作用，机制可能是竞争抑制功能为促进受生长素诱导基因的表达的促进子（activator）与DNA的结合。功能缺失型突变体arf2对BR抑制剂BRZ的敏感性下降，说明ARF2在BR介导的生长过程中式一个负调控因子。在体外，BIN2能降低ARF2的转录抑制活性并且抑制它DNA结合部位的活性（88）。有人提出假设BIN2通过抑制ARF2的活性来促进BR和生长素水平（88）。但是BIN2作为一个BR通路的负调控因子，其活性受到BR的抑制（42,65），这就导致了BR的存在激活了ARF2。这似乎与ARF2的在下胚轴伸长过程中的负调控功能相矛盾，但与ARF2在促进雄蕊伸长和衰老过程相符（19）。ARF2对BR信号通路的调节机制和ARF2在BR反应中的功能有待于进一步的深入研究。
BSU1介导的Tyr去磷酸化和蛋白酶体介导的蛋白降解调控BIN2
人们确信BR通过抑制BIN2来诱导BZR转录因子的去磷酸化，但是尚不清楚BIN2活性是怎样被上游信号抑制的。在动物系统中，GSK3β在Wnt信号通路中的作用于BIN2在BR信号通路中的作用相似。GSK3β磷酸化β-catenin，进而促进其降解和细胞质中保留。这与BIN2与BZR1/2的调节类似。在哺乳动物中，GSK3β的行为受到它N端结构域的磷酸化、蛋白复合体的形成和其底物的磷酸化调节（54）。但是这个机制并不适用于BIN2对于BR信号通路的调节（48）。BZR1/2的一个由12个氨基酸构成的结合模体形成与BIN2的结合口袋，但是目前尚不清楚BR是否调节BIN2与BZR1/2的结合（48）。同时Peng及其同事（65）曾经报导BR诱导BIN2的快速降解，这个过程能被26S蛋白酶体抑制剂MG132所阻断。有趣的是，bin2-1突变体蛋白能在细胞内积累而在BR处理时不被降解，这为蛋白酶体在BR信号通路中BIN2的降解过程中发挥重要功能提供了遗传学依据。但是最初引发BIN2降解的机制尚未发现（65）。
最近,Kim及其同事（42）通过免疫印迹和双向电泳检测到BR诱导的BIN2降解过程。结果表明BIN2的降解可能需要蛋白磷酸酶的参与。最终发现这个磷酸酶即是BSU1（bri1 SUPPRESSOR 1），它当初被认为是介导BZR2的磷酸化。
BSU1是通过激活标记筛选bri1-5基因的等位基因发现的（57）。BSU1包含一个N端
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的Kelch重复结构域和一个C短与磷酸酶1(PP1)同源的磷酸酶结构域。BSU1的过表达抑制bri1突变而且引起BZR2的磷酸化积累。BSU1同源蛋白的RNAi抑制引起弱的矮小表型（57）。通过T-DNA敲除bsu1、bsl1和RNAi抑制BSL2和BSL3的方法构建的BSU1家族的4重功能缺失型突变引起极度的矮小表型，与bri1无义突变体类似，进一步证实了BSU1在BR信号通路中的正调控作用（42）。
当BZR1或BZR2，BIN2,BSU1在体外混合时，BZR1或BZR2的磷酸化被BSU1抑制。但是BSU1的活性在体外更温和，推测在体内BSU1可能通过去磷酸化BZR1和BZR2来激活BR应答，但是需要翻译后修饰以及合作蛋白（46,57）。但是,Kim及其同事最近发现，如果在加入BSU1之前除掉BIN2，重组BSU1或免疫纯化的植物BSU1并不能使被BIN2磷酸化的BZR1去磷酸化（42）。只有当BIN2与BSU1同时存在时，BZR1或BZR2的磷酸化才会像之前报导的那样受到抑制。用未被32P-ATP完全磷酸化的BZR来分辨去磷酸化及被cold ATP磷酸化。结果显示BSU1抑制BIN2的磷酸化，但是并不能直接使BZR1去磷酸化。另外，BR处理促进免疫纯化的BSU1对野生型BIN2的抑制。BSU1不能抑制bin2-1对BZR1的磷酸化，引起bin2-1的对BR不敏感表型。与BR处理类似，BSU1的过表达抑制了BIN2蛋白水平，但是并不能抑制bin2-1的水平（42），虽然它能部分挽救杂合子bin2-1的矮小表型。这些结果都证明了BSU1在BRI1的下游而在BIN2的上游（42）。进一步的实验证明了在体内和体外，BSU1均能与BIN2互作（42）。
重组BIN2的质谱分析发现Tyr200是BIN2的一个自磷酸化位点（42）。Tyr200在GSK3家族完全保守，而且对于哺乳动物GSK3家族这个位点的磷酸化需要BIN2的激酶活性的参与。Tyr200突变为Phe能使BIN2和bin2-1过表达植株完全失去引起矮小表型的能力，这说明Tyr200对于BIN2在体内的作用至关重要。在体外有BSU1存在情况下，或在体内BR处理条件下，Tyr200受到野生型BIN2磷酸化的水平均受到抑制（42）。有趣的是，Tyr200突变型蛋白bin2-1磷酸化的水平并不受BSU1或BR处理的影响，这说明蛋白bin2-1突变的最大影响是阻碍了BSU1对Tyr200的去磷酸化作用。这些结果进一步证明BSU1介导的Tyr200的去磷酸化过程是BR信号抑制BIN2活性的主要机制（42）。AtSK12的Tyr233位点（与BIN2的Tyr200位点相对应）在BR处理时同样去磷酸化。所以，BSU1介导的Tyr200去磷酸化似乎是BR信号通路中GSK3家族的普遍机制（42）。
将BSU1置于BIN2的上游使得BSU1与处于细胞膜上的BSKs的直接互作看起来有了可能性，这样就可以将BR信号通路中的空隙连上了。虽然BSU1主要定位于细胞核，在细胞质中只能观察到少量的BSU1（42,57）。显微镜观察和蛋白质组学研究证明BSU1的同源蛋白（BSL1,BSL2和BSL3）定位于细胞膜和细胞质，使得与定位于细胞膜上的组分的直接互作有了可能（42）。实际上，体外互作实验显示BSU1能与BSK1互作，但是不能与BRI1或BAK1互作（42）。当BSK1被BRI1磷酸化时，互作增强，而当BSK1被BRI1磷酸化的位点（S230A）发生突变时，互作作用完全消失。免疫共沉淀和BiFC实验证实了BSU1和BSK1在体内的互作（42）。这些结果表明BRI1对BSK1 S230位点的磷酸化促进了BSU1与BSK1的互作（42）。至此，BR通路的所有主要的组分，从细胞表面受体BRI1激酶到细胞核转录因子都有机联系起来了。完整的BR信号通路阐述了通路前后的分子事件：BR结合到细胞表面的BRI1，BRI1激酶通过与共受体BAK1的配体诱导契合和相互磷酸化、BKI1的解离而被激活，BRI1继而磷酸化BSK1，接着激活BSU1，使得BIN2由于BSU1催化其Tyr的去磷酸化而被抑制，引起去磷酸化BZR的核内累积和BR应答基因的表达（42）。
BR通路（图）是迄今为止植物体内第一个由受体激酶介导的完整的信号转导通路，它为了解植物信号转导通路提供了范例。BR通路中许多信号传递机制都与其他信号通路有相似性。比如BRI1-BAK1的激酶激活是通过受体诱导的同源二聚体和相互磷酸化来实现的，这个机制在也存在于其他RLKs中。GSK3-like激酶 Tyr位点被BSU1（一个PP1相关的磷
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酸酶）去磷酸化过程与哺乳动物中存在的一种保守机制类似，因为哺乳动物中的GSK3家族和PP1的同一个tyr位点的磷酸化也在Wnt通路中GSK3β的上游起重要作用。通过Tyr位点的磷酸化对BIN2和BRI1的调节明显奠定了Tyr的磷酸化作为一个普遍机制在植物信号转导中的重要作用。虽然在植物中未发现动物Tyr激酶的同源蛋白，但是许多植物激酶似乎对Ser/Thr和Tyr有双特异性（dual specificity）。
图3：BR信号通路。图中粉色为处于激活状态的组分，蓝色为处于非活性状态的组分。黄色圈代表磷酸化 情况下，为正调控而红色圈代表磷酸化为负调控。（a）没有BRBKI1与非活性状态的BRI1结合，阻止BRI1
的结合。与BAK1与BRI1结合的BSKs保持非活性状态。相应地，BSU1也处在非活性状态。激活状态的BIN2 （Tyr200被磷酸化）组成型地磷酸化BZR1和BZR2，引起后两者依赖14-3-3的核输出和细胞质保留、DNA 结合能力的丧失和被蛋白酶体降解的过程。（b）有BR存在情况下，BR与BRI1结合，诱导BAK1的结合和BKI1 的解离。随着BRI1和BAK1的相互磷酸化，BRI1被充分激活并磷酸化BSKs。接着被磷酸化的BSKs
从受体复合体上解离下来并结合到BSU1，这个过程可能提高了BSU1的活性。被激活的BSU1通过去磷酸 的tyr磷酸化位点抑制它的活性，这又使得去磷酸化的BZR1和BZR2得以在核内积累。有活性的化BIN2
BZR1和BZR2与基因组DNA结合，调节BR靶基因的表达，从而来调节植物的生长和发育。
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结语
遗传学、生物化学、蛋白组学方法的结合使人们对BR信号通路的机制的深入认识有了快速进步。
完整的BR信号通路阐明了通路前后的分子事件：BR结合到细胞表面的BRI1，BRI1激酶通过与共受体BAK1的配体诱导契合和相互磷酸化、BKI1的解离而被激活，BRI1继而磷酸化BSK1，接着激活BSU1，使得BIN2由于BSU1催化其Tyr的去磷酸化而被抑制，引起去磷酸化BZR的核内累积和BR应答基因的表达。但是仍然还有许多问题需要回答。比如，BSKs是如何调节BSU1活性的？哪种磷酸酶催化BZR1的去磷酸化以及BR通路如何调节它？BR信号通路中是否有激酶或磷酸酶直接调节细胞通路以外的其他过程？更刺激和有挑战性的问题是，这个线性的通路如何办到能去调节各种各样发育和生理反应的？BZR1和BZR2直接的靶基因的确定是最重要的关键，它关系到下游引起各种特异反应的各支路通路的研究以及与其他通路互相整合的转录网络的分析。最终我们将要去了解BR信号通路在整个组织，器官甚至生物体中的作用过程（44,45,71）。然而，最重要的是关于BR功能的知识需要运用到遗传工程中去，来改良食物和生物工程产品。
参考文献（LITERATURE CITED）：
1. Aitken A. 2006. 14-3-3 proteins: a historic overview. Semin. Cancer Biol. 16:162–72 2. Albrecht C, Russinova E, Hecht V, Baaijens E, de Vries S. 2005. The Arabidopsis thaliana SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASES1 and 2 control male sporogenesis. Plant Cell 17: 3337–49
3. Albrecht C, Russinova E, Kemmerling B, Kwaaitaal M, de Vries SC. 2008. Arabidopsis SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR KINASE proteins serve brassinosteroid-dependent and -independent signaling pathways. Plant Physiol. 148:611–9
4. Astle S, Khan RN, Thornton S. 2003. The effects of a progesterone metabolite, 5 betadihydroprogesterone, on oxytocin receptor binding in human myometrial membranes. BJOG110:589–92
5. Bai MY, Zhang LY, Gampala SS, Zhu SW, Song WY, et al. 2007. Functions of OsBZR1 and 14-3-3 proteins in brassinosteroid signaling in rice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:13839–44
6. Bridges D, Moorhead GB. 2005. 14-3-3 proteins: a number of functions for a numbered protein. Sci. STKE 2005:re10
7. Burger K, Fahrenholz F, Gimpl G. 1999. Non-genomic effects of progesterone on the signaling function of G protein-coupled receptors. FEBS Lett. 464:25–9
8. Cano-Delgado A, Yin Y, Yu C, Vafeados D, Mora-Garcia S, et al. 2004. BRL1 and BRL3 are novel brassinosteroid receptors that function in vascular differentiation in Arabidopsis. Development 131:5341–51
9. Chandler JW, Cole M, Flier A, Werr W. 2009. BIM1, a bHLH protein involved in brassinosteroid signaling, controls Arabidopsis embryonic patterning via interaction with DORNROSCHEN and DORNROSCHEN-LIKE. Plant Mol. Biol. 69:57–68
10. Chinchilla D, Zipfel C, Robatzek S, Kemmerling B, Nurnberger T, et al. 2007. A
flagellin-induced complex of the receptor FLS2 and BAK1 initiates plant defense. Nature 448:497–500
11. Choe S, Schmitz RJ, Fujioka S, Takatsuto S, Lee MO, et al. 2002. Arabidopsis
brassinosteroid-insensitive dwarf12 mutants are semidominant and defective in a glycogen synthase kinase 3beta-like kinase. Plant Physiol. 130:1506–15
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