附件4
耐药性检测结果登计表
（1）肠道菌耐药性检测结果统计表 养殖场： 检测员： 氨 阿莫西林/克拉维酸 头 孢 噻 呋 A/C EFT 庆 大 霉 素 GM 大 观 霉 素 SPT TE DO 四 多西环 环素 素 氟 苯 尼 考 FFC 磺 胺 异 恶唑 SF 复方新 诺 明 SXT 年 月 日
恩 诺 沙 星 ENR 二 氟 沙 星 NOR 多 粘 菌 素E PME 菌株 苄 西 编号 林 AM 注：直接填写检测的MIC数值。
（2）金葡菌耐药性检测结果统计表 养殖场： 检测员： 青氨 苄 西 林 阿莫西林/克拉维酸 头 孢 西丁 头 孢 噻 呋 红 霉 素 磺 胺 异 恶唑 复方新 诺 明 克林霉素 替米考霉 年 月 日
恩 诺 沙 星 氧氟沙星 万 古 霉 素 菌株 素 编号 p 星 AM A/C CX EFT EM SF SXT CLI TIL) ENR NOR VA 注：直接填写检测的MIC数值。
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附件5
动物源细菌分离和鉴定方法
一、大肠杆菌、沙门氏菌的分离和鉴定 1.范围
本方法规定了用于耐药性测定的动物源大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定方法。
本方法适用于各种动物及其组织中大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定。 2.设备和材料
2.1 冰箱：0℃-4℃和-20℃。 2.2 恒温培养箱：37℃±1℃和42℃。 2.3 显微镜：10×--100×。 2.4 采样管。
2.5 采样棉拭子、剪子。 2.6 灭菌试管。 2.7 平皿。
2.8 自动细菌鉴定仪。 2.9 API 20E试子条。 2.3 恒温摇床 2.4 冻存管 3.培养基和试剂 3.1 运送培养基
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3.2 麦康凯琼脂
3.3 沙门氏菌显色琼脂或XLT4琼脂 3.4 营养肉汤
3.5 鉴定用大肠杆菌、沙门氏菌阳性血清 3.6 四硫磺酸盐增菌液（TTB） 4.大肠杆菌和沙门氏菌分离和鉴定程序 大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定程序见图1
动物泄殖腔拭子 发病动物带菌组织（做成匀液） 运送培养基或营养肉汤 用接种环接种于麦康凯琼脂 按1:10接种四硫磺酸盐增菌液（TTB）42℃24h 挑取大肠杆菌可疑菌落纯化 沙门氏菌显色培养基或XLT4琼脂 挑取沙门氏菌可疑菌落纯化 三糖铁（TSI）和硫氧化酶试验（阴性） 检测invA基因确认 化物吲哚运动性培养基（SIM）鉴定 API 20E试条 沙门氏菌 大肠杆菌 自动细菌鉴定仪 大肠杆菌 沙门氏菌
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图1：大肠杆菌和沙门氏菌的分离和鉴定程序 5.操作步骤 5.1 采样
到已选定的养殖场或屠宰场，用灭菌棉签采动物泄殖腔样品，置入1-2ml肉汤或运送培养基中0-4℃保存。采发病动物组织时，用无菌操作取少量动物组织至于灭菌试管内，0-4℃保存，不超过48小时。 5.2 大肠杆菌的分离
5.2.1 取泄殖腔拭子样品用接种棒直接接种于麦康凯琼脂平面，动物组织样品首先制成匀液，然后用接种棒接种于麦康凯琼脂平面，37℃培养18-24小时。
5.2.2 挑取粉红色、边缘光滑的大肠杆菌可疑菌落，用麦康凯培养基纯化一代，然后接种于营养琼脂平面37℃培养12-24小时，待进一步细菌鉴定。 5.3 沙门氏菌的分离
5.3.1 将泄殖腔拭子或制成匀液的动物组织样品与增菌培养基按1:10的比例，接种于TTB增菌液中，42℃培养24小时。
5.3.2 将增菌液摇匀，用接种环接种于沙门氏菌显色培养基37℃培养22-24小时或XLT4琼脂上42℃培养22-24小时。
5.3.3 将沙门氏菌显色培养基上紫色的沙门氏菌可疑菌落或XLT4琼脂培养基上中央黑色边沿透明的沙门氏菌可疑菌落接种于营养琼脂平面37℃培养16-24小时，待进一步细菌鉴定。
5.4 大肠杆菌和沙门氏菌的鉴定（以下方法可任选其一）
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5.4.1 API 20E试验条鉴定
5.4.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行氧化酶试验（附注1），应为阴性。
5.4 .1.2 将待检细菌单个菌落，悬浮于5ml灭菌生理盐水，用API 20E试子条按照使用说明书（附注2）操作，菌液和试剂滴加完毕后，37℃培养18-24小时，用细菌鉴定仪判读结果。
5.4.1.3 将鉴定出的大肠杆菌和沙门氏菌结冻保存，待进行药敏试验。
5.4.2 其它方法 5.4.2.1 大肠杆菌的鉴定
5.4.2.1.1将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌，首先进行氧化酶试验（附注1），应为阴性。
5.4.2.1.2 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌用穿刺法接种于三糖铁（TSI）琼脂中，37℃培养22-24小时，观察结果应表面黄色，H2S阴性，产气。
5.4.2.1.3 将在营养琼脂上培养24小时以内的待鉴定细菌用穿刺法接种于硫化物吲哚运动性培养基（SIM），37℃培养22-24小时，观察结果应产气，H2S阴性，运动或不运动，吲哚阳性。
5.4.2.2 沙门氏菌的鉴定：设计invA基因的引物，上游为5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′，下游为5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C -3′，反应条件：95℃预变性5min，94oC 30s, 64oC 30s, 72oC 30s for 30 cycles，得到扩增长度为284 bp的扩增产物为沙门氏
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