附件6
抗菌药敏感性试验操作方法和判断标准
一、抗菌药物敏感性试验（微量肉汤稀释法）操作方法 1．目的
本操作方法用来规范微量肉汤稀释法测定肠道杆菌最小抑菌浓度（MIC）的操作，并统一判定标准。 2．适用范围
本标准操作规程适用于按照微量肉汤稀释法进行肠道杆菌和金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度的测定（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌除外）。 3．职责
进行该试验的检验员应当按照本标准操作规程进行。 4．试验依据与原理
微量肉汤稀释法测定细菌最小抑菌浓度是定量检测某一抗生素对细菌体外活性的一种标准方法。试验在制成一系列各种浓度的抗生素肉汤溶液中分别加入等量的一定浓度的菌液，过夜培养后，判读最小抑菌浓度（MIC）。 5．材料、仪器与试剂的准备及基本要求 5.1 材料和仪器
5.1.1 操作室：操作室内设有能达到空气消毒的紫外灯。实验前后应用75%乙醇溶液擦拭操作台面及可能污染的死角，开启紫外灯杀菌1小时。 5.1.2 旋涡混合振荡器：可调速 5.1.3 恒温培养箱：35±2℃
5.1.4 灭菌试管、容量瓶、刻度吸管等。
5.1.5 园底96孔板、接种针或接种环（镍铬丝或一次性无菌塑料制品）。 5.1.6 无菌衣、裤、帽、口罩：用牛皮纸包严，灭菌备用或用一次性的无菌物品代替。
5.1.7 8头或12头移液器、吸头等 5.2 试剂与培养基 5.2.1 75%乙醇溶液
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5.2.2 无菌0.9%氯化钠溶液 5.2.3 新洁尔灭（1:1000）溶液 5.2.4 营养琼脂培养基
5.2.5 水解酪蛋白肉汤（Mueller-Hinton broth Medium，MH肉汤，含20-25 mg钙/ L，10-12.5mg镁/L）
5.2.5.1 10mg/mL Ca2+ 和Mg2+的配制
Ca2+的配制：3.68g CaCl2?2H2O加入100mL三蒸水中，含量为10mg Ca++/mL，0.22μm滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱保存备用。
Mg2+的配制：8.36g MgCl2?6H2O加入100mL三蒸水中，含量为10mg Mg++/mL，0.22μm滤膜过滤除菌后置于4℃冰箱保存备用。
5.2.5.2 使用时加入适量的Ca2+和Mg2+到MH肉汤中，使MH肉汤中Ca2+和Mg2+的含量分别为20-25 mg Ca2+/ L和10-12.5mg Mg2+/L。 5.2.7 抗菌药物：一般采用标准品或对照品 5.3 质控菌种
5.3.1 肠道菌质控菌株：大肠杆菌ATCC 25922。 5.3.2 金葡菌质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC 29213。 5.4 抗菌药物贮备液的制备 5.4.1抗菌药物的称量
计算公式： W(mg)=
V(ml)?C1(?g/ml)
C2(?g/mg)式中：W—称取抗菌药物的重量； V—制备抗菌药物的溶液体积； C1—制备抗菌药物的溶液浓度； C2—抗菌药物的含量。
5.4.2 加入一定量的溶剂稀释至一定浓度。贮备液的浓度至少应为1280μg/ml，或最高测试浓度的10倍以上。
5.4.3 将抗菌药物贮备液分装于无菌小瓶中，最好置-70℃以下保存，有效期为半年。注意不能反复冻融。临用前从冰箱中取出，使融解并与室温一致。
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5.5 0.5麦氏单位（McFarland）标准比浊液或比浊计
药敏试验菌悬液的浊度，以BaSO4浊度液为标准，相当于0.5麦氏单位（McFarland），按如下方法配制：
5.5.1 取0.048mol/L的氯化钡溶液（1.175%w/v，BaCl2·2H2O）0.5ml，加至99.5ml 0.18mol/L的硫酸溶液（1%v/v）中，不断搅拌使成混悬液。
5.5.2 用1cm光路的吸收池，在625nm下测定6.2.1的溶液，0.5标准麦氏单位(Mcfarland standard)的吸收度应为0.08～0.10。
5.5.3 取4～6ml硫酸钡混悬液，置与稀释菌悬液相同规格的具塞试管中，密封，室温避光保存。
5.5.4 临用前将标准比浊液在漩涡震荡器上混合均匀，如出现大颗粒，则需重新配制。放置后硫酸钡标准比浊液的浊度会产生变化，因此应每月进行更换。
6 测定步骤 6.1 分离单菌落
将质控菌株和测试菌株分别用四分划线法转种于营养琼脂平面，置37℃培养箱中培养，以得到单个纯菌落。 6.2 抗生素工作溶液的制备
将抗菌药物贮备液用M－H肉汤稀释至一定的工作浓度后，按2倍稀释法进一步稀释至一系列所需浓度(一般10个浓度梯度)，然后按顺序用排枪点入96孔板中，每块板横向10个稀释度，每孔0.1ml，设阴性和阳性对照，可测8个细菌。 6.3 菌液制备 6.3.1 生长法
6.3.1.1 用接种环挑取营养琼脂斜面上的3～5个质控菌或供试菌单个纯菌落，加入无菌4～5ml肉汤（如胰酶消化大豆肉汤）的试管中。
6.3.1.2 置35~37℃培养箱中培养，一般为2～6小时，使培养后的菌液浓度达到或超过0.5标准麦氏单位。
6.3.1.3 将培养好的菌液与比浊液管置比色卡上对着光源比较，适当情况下可用无菌生理盐水或肉汤稀释菌悬液，使两者浊度一致，即菌悬液的浓度为0.5标准
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麦氏单位，在该浓度下质控菌株ATCC 25922的菌液浓度为1～2×108CFU。也可采用分光光度计测定并调节菌液浊度。 6.3.2 直接制备菌液法
该法较生长法简便，用接种环挑取琼脂平板上培养16～18小时的3～5个单菌落，用无菌生理盐水或M-H肉汤稀释至0.5麦氏单位。
6.3.3 将调节至0.5麦氏单位的菌液用M-H肉汤或生理盐水稀释100倍，约5X105-106CFU/ml浓度。
6.3.4 取5X105-106CFU/ml浓度的菌液0.1ml分别加入含系列抗菌药物溶液的板中, 混匀，试管中最终抗菌药物的浓度为原稀释浓度的一半。 6.4 培养
将加有菌液和抗菌药物的板，置35℃培养箱中培养16～20小时。 6.5 结果测定
取出培养后的板，观察结果，以无菌生长的最低抗菌药物溶液的浓度为最低抑菌浓度（MIC）。 6.6 结果判断
在质控菌株的最低抑菌浓度符合规定范围（附注1和2）的前提下，按判断标准（附注1和2）判断被检菌株的敏感性－敏感，中度敏感或耐药。对于只给出敏感判断标准的药物，只报告其是否敏感即可。 7．注意事项
7.1 冷冻或冻干菌株应培养两代后才可用于测定。 7.2 调整好浊度的菌液应于15分钟内稀释至工作浓度。 7.3 M-H肉汤的质量对试验结果的影响
7.3.1 M-H肉汤是常规药敏试验中的最佳培养基，含磺胺，甲氧苄啶和四环素抑制剂较少，能满足大多数快速生长的需氧菌或兼性厌氧菌的营养需求。 7.3.2 试验一般采用商品脱水培养基，临用时按照使用说明书进行配制，需注意培养基的pH值应为7.2～7.4。
7.3.3 有些生产商能直接提供已调节阳离子浓度的M-H肉汤，否则需用原子吸收光谱仪测定。
7.3.4 新鲜配制的培养基，应按规定的处方，对培养基的原材料要进行挑选，
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所选用的化学试剂均应为分析纯。
7.3.5 如分离的菌种不典型或试验结果前后不一致时，应对菌种进行重新鉴定或重新进行药敏测定。 8. 名词解释
8.1 敏感 (Susceptibillity, S)：表明该菌株所致感染可以用推荐的抗菌药物剂量进行治疗，除非存在禁忌症。
8.2 中介(Intermediate, I)：用抗菌药物MIC浓度治疗菌株感染，可使血液和组织中药物浓度接近通常可达到的水平，而抗生素治疗的反应率可能低于敏感株。意味着药物生理浓度部位具有临床效力（如尿液中的喹诺酮类和β－内酰胺类）或可用高于正常剂量的药物进行治疗（β－内酰胺类）。该类还包括一个缓冲区，可防止微小的，未能控制的技术因素造成的结果解释错误，特别是对那些安全范围窄的药物。
8.3 耐药(Resistance, R)：指按常规剂量使用，抗生素通常达到的全身浓度不能抑制其生长的菌株，和/或某些抗菌药物的抑菌圈直径在耐药机制范围，且临床治疗效果不可靠。 9．参考文献
9.1 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;fifteenth Informational Supplement.Clinical and Laboratory Standards Institute.
9.2 Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals；Approved Standard-Second Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute.
9.3 Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-sixth Edition. Clinical and Laboratory Standards Institute.
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