1 材料与方法 1.1实验材料
1.2实验方法
1.2.1 MjCBP RNA水平组织分布和表达模式 1.2.2 MjCBP的克隆，重组表达载体的构建 1.2.3 MjCBP蛋白的重组表达、纯化 （1.2.4 MjCBP多克隆抗体制备）
（1.2.5 MjCBP蛋白水平组织分布、表达模式） 1.2.6 干扰后弧菌清除实验，过表达后弧菌清除实验
2 实验结果 2.1 进化树
2.2 组织分布和表达模式 2.3 纯化
2.4 弧菌刺激 血、肠 进化树
使用ClustalW1.8 软件, 将剑尾鱼P-gp 推断的氨基酸序列与GenBank 中登录的其他动物P-gp 进行多序列比对, 采用MEGA4.0 软件包进行构建系统树。
用NCBI BALST(http：//blast．ncbi．nlm．nih．gov／blast．cgi)、ExPASy_ProtParam(http：／／web．expasy．org／protpa—ram／)、PredictProtein(http：／／www．predictprotein．org／)、SignalP 4．1 Server(http：／／www．cbs．dtu．dk／cgi—bin／1和NCBI CDD(http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／Structure／cdd／)等在线工具对猪MNSF[3的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析
用DNAMAN软件对猪MNSF[3与人、小鼠等18个物种的MNSFl3进行蛋白相似性分析和进化树分析。
猪MNSFl3与其他物种MNSFIB的同源性分析利用NCBI BLAST在GenBank中搜索不同物种MNSFl3的同源序列，用DNAMAN软件对克隆得到的猪MNSFl3与18个不同物种的MNSFp蛋白序列进行相似性比对并绘制MNSFIB蛋白无根进化树。在蛋白水平上，猪MNSFl5与其他18个物种的相似性在91．73％～97．74％之间，与小鼠MNSFl3蛋白相似性最高，达到97．74％，与人的MNSFl3蛋白相似性为93．98％(附表1)。MNSFl3蛋白的无根进化树分析结果显示猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)、绵羊(Ovisaries)、虎鲸(Orcinus orca)和宽吻海豚(Tursiops truncatus)可聚成一类，亲缘关系较近。在所有比较的物种中其进化距离都小于o．05，说明MNSFl3在不同物种间高度保守(附图2)。
从转录组文库中获取得到橘小实蝇8个Rab基因的核苷酸序列信息。用DNAman完成核苷酸序列编辑及氨基酸序列推导。通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)站点的BLASTX 0attp：／／www．nebi．nlm．nih．gov)查找各Rab基因的高相似性序列。用ClustalX 2．0对橘小实蝇Rab家族基因氨基酸序列进行多重比对，分析其保守性，揭示其活性位点。用MEGA5．0软件neighbor-joining方法对8个Rab基因构建进化树，根据bootstrap方法用1000个重复进行统计分析。
从NCBI中查找到的与橘小实蝇BdRabl氨基酸序列相似度较高的Rabl氨基酸序列所对应的不同昆虫，其中图3—2从上到下依次为欧洲熊蜂、印度跳蚁、顶端切叶蚁、佛罗里达弓背蚁、丽蝇蛹集金小蜂、赤拟谷盗、埃及伊蚊、橘小实蝇、黑腹果蝇、木槿曼粉蚧。其中橘小实蝇BdRabl与黑腹果蝇DmRabl进化距离最近。 组织分布
用实时荧光定量RT-PCR 法进行了P-gp 基因的组织分布
按照 QIAGEN RNeasy Mini Kit 试剂盒分别提取1.1 中保存的每尾剑尾鱼8 种组织总RNA, 每份RNA 作为１个样本, 1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和完整性, 用核酸蛋白测定仪测定RNA样品的浓度和纯度。采用 SYBR PrimeScript RT-PCR Kit进行反转录合成cDNA 模板。
荧光定量PCR在ABI 7500 (Applied Biosystems)实时荧光定量PCR仪进行, 目的基因的定量PCR引物序列(表1)。反应体系为20 μL: SYBR? Premix Ex Taq? Ⅱ(2×) 10 μL, ROX Reference Dye II (50×)0.4 μL, 20 μmol/L的上下游引物各0.4 μL, cDNA 1 μL,加双蒸水补足反应总体积为20 μL。反应条件为: 95℃预变性30s; 然后95℃ 5s, 60℃ 34s, 扩增40个循环,60℃延伸时采集荧光信号, 反应结束后对扩增产物进行溶解曲线分析, 以确保特异性扩增。样本和内参分别设3个重复, 以β-actin作为内参基因校正实验误差。采用相对2?ΔΔCt法进行P-gp mRNA 在剑尾鱼各组织器官中的表达分析。结果用Excel软件进行计算和单因素方差分析,实验数据用平均值表示。
P-gp 基因在剑尾鱼不同组织分布的实时荧光定量检测
以 QSFPGP 为引物, 剑尾鱼心、肝、脾、肾、脑、肌肉、鳃、眼睛8 个样本cDNA 为模板, β-actin为内参基因,应用荧光定量RT-PCR 方法研究剑尾鱼P-gp mRNA 的组织器官表达特征(图2)。结果表明剑尾鱼P-gp mRNA 在8 种组织中均有表达, 在肝、脑的表达量显著高于其他几个组织, 其次是肾和眼睛, 脾中P-gp mRNA 表达量最低。方差分析结果表明, 肝与脑P-gp mRNA 表达量之间差异显著(P<0.05), 肝和脑与其他6 个组织部位之间存在着极显著差异(P<0.001), 而肌肉和鳃(P=0.053)、肾和眼睛(P=0.102) P-gp mRNA 表达量无显著差异。剑尾鱼各组织P-gp mRNA 表达量依次为肝>脑>肾>眼睛>肌肉>鳃>心>脾。
实时荧光定量PCR，是指在PCR 扩增反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对起始模板进行定量及定性分析的方法。在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR
反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
以2.1.4.3.2 生成的cDNA 链为模板，使用表2-1 中的引物，以表2-2 中的体系和程序在iCycler iQ Multicolor 荧光定量PCR 仪上进行PCR 扩增。PCR 结果采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。
如图2-1 所示，经Trizol 法提取各种时期的胚胎及成体斑马鱼脏器的RNA，标号1 为肝脏的RNA；2 为脾脏；3 为肾脏；4 为心脏；5 为30hpf 的胚胎及6 为60hpf的胚胎。其中28s,18s,5s 三条条带都比较清晰，无明显DNA 污染，无明显降解条带，表明总RNA 提取比较成功。用Hox 基因和?-actin 定量PCR 引物扩增斑马鱼cDNA 模板。PCR 产物经电泳检测后可见大小介于200-500bp 的特异性目的条带，与设计的片段大小相符。通过溶解曲线分析发现cDNA 的PCR 产物呈现单一峰。计算ΔCt：ΔCt=Ct (靶基因)－Ct (?-actin)。该实验的靶基因分别为肝脏、脾脏、肾脏、心脏、30hpf 胚胎及60hpf 胚胎中的Hox 基因。按照2.1.4.3.3 的实验方法，分别对41 个Hox 基因在30hpf 胚胎、60hpf 胚胎及成鱼肝脏、脾脏、心脏及肾脏中的mRNA 表达水平进行检测。结果如表2-3 显示
采用Trizol法提取猪不同组织的总RNA，反转录得到cDNA，根据已克隆的猪MNSFfl全长cDNA序列，设计RT-qPCR特异性引物。上游引物P5：5’．CTTGGAGGTAAAGTTCAT-3’；下游引物P6：57一TATTGcATAcGTcTcTTG．3’。以
猪
p-actin
基
因
序
列
为模
板
设
计
内参
引
物
13-actin．F(5’．GGATGCA．GAAGGAGATCACG-3’)和13-actin-R(5’一CTCGTCG—TACTCCTGCTTGC．3’)。用RT-qPCR检测猪MNSFl3在各组织中的相对表达量。20此反应体系：cDNA模板2此，上下游引物混合液0．2“L(20 pmol／I．tL)，SYBRgreen Real—time PCR master mix 1 0 laL，加ddH20至20 pL。PCR扩增程序：95℃3 min；95℃10 S，55℃30 S，40个循环；最后为溶解反应，试验重复3次，使用Bio．Rad IQ5软件对RT-qPCR试验数据进行统计分析。
实时荧光定量PCR结果显示，猪MNSFfl在肝脏中表达量最高，其次是扁桃体和肾脏，在心脏、脾脏、胸腺、肠系膜淋巴结、肺门淋巴结、腹股沟浅淋巴结和下颌淋巴结中低水平表达，在肺脏中未检测到表达(图5)。
橘小实蝇转录组文库显示的参与发育和繁殖相关的8个差异表达基因分别是Jonah 44E1 Trypsin、AKT,mediator complex，hormone receptor 3，Broad，Rab7、ACPl。根据转录组测序信息设计目的基因的荧光引物，以非差异表达基因technical knockout作为对照基因，以橘小实蝇16S rRNA作为内参基因，利用实时荧光定量PCR检测各基因的表达情况。
实时荧光定量PCR用iQTM SYBR@Green Supermix(Bio．Rad，usa)试剂盒在Bio—Rad iQ5双色实时荧光定量PCR仪上进行。每个样品设三个重复，根据需要设置相应空白对照，PCR总体系为lOul。荧光定量PCR结束后分析溶解曲线，以确保特异性扩增。实时荧光定量PCR结果由Optieon Monitor软件2．03Version(MJ research，USA)量值2-a ct方法分析，以1 6S rRNA表达量校正目的基因的相对表达量。
半定量 RT- PCR 根据已获得的围食膜蛋 白基因序列设计引物( PT1: 5'- ACAAGCCTT- CACTCGCCAC- 3'; PT2: 5'- TCGAATACCATG- CCATCTG- 3') ， 该引物用于感染 IHHNV 和抗感 染IHHNV 对虾肠道 肝胰腺等组织表达谱的研究， 设 立 内 参 - actin ( 引 物 序 列 为 actin1: 5'- CGAGAAATCGTTCGTGAC- 3'和 actin2: 5'- GATG- GAGTTGTAGGTGGTCT- 3') 半定量 RT- PCR 的 扩增体系为 cDNA 1 L， 10 mol /L 的上 下游引