体内清除实验
将约为7 g的对虾分成3组,每组18只。将冻存的重组蛋白溶液于PBS中透析,调整其浓度为400μg/mL。将500μL蛋白溶液与鳗弧菌(共4xl08个细胞，重悬于PBS中)混合置于28°C轻摇30 min,BSA和PBS作为蛋白的对照，也进行同样的处理。
将每组中蛋白与细菌的混合物50μL分别注射入对虾腹节内,因此每只虾注射的蛋白为10μg,细菌为2x10个。在2 min、5 min、10 min、30 min、1h和3h时,从3只对虾内抽取500μL血淋巴,将其与等体积抗凝剂混勾。将混合物以灭菌PBS稀释1000倍,取30μL样品涂布2216E平板(0.5%胰蛋白胨,0.1%酵母提取物,0.1tCl3,1.5%琼脂,2.4%海盐)。平板于37°C培养过夜后,对菌落计数,并计算细菌残留率(不同时间点时细菌数量/注射1 min时细菌数量)。
在抗体封闭实验中,选取6只虾,其中3只分别注射50μL兔FcLec4抗血清,另3只注射等量兔免疫前血清。注射1h后,每只虾注射2xl07个鳗弧菌。30 min后,抽血并计细菌数,计算残留率。实验重复3次,结果进行t-检验,当P<0.05时视为显著性差异。
FcLec4重组蛋白可加快机体对鳗弧菌的清除速度
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由于FcLec4重组蛋白可以紧密结合于鳗弧菌表面,我们检测了其在体内的可能作用。将细菌与蛋白事先孵育,注射入对虾体内,然后检测蛋白对于细菌清除作用的影响。结果发现,如图3.8A所示,在FcLec4、BSA和PBS三组中,细菌清除速度在3 h内完成。在刚注射后,三组并没有明显差异。而在5min后,实验组的细菌数量(残留率)明显低于两个对照组,说明本组清除作用更为有效。在注射后1h时,实验组中将近95%的细菌都被清除,而相同的效果在对照组中知道3 h时才能达到。
另外,应用抗血清封闭对虾体内的天然蛋白,可以发现,在注射细菌30min后,实验组的清除速度要慢于对照组(图3.8B)。这些结果说明FcLec4能够促进对虾机体对于鳗弧菌的清除作用。
蛋白纯化
FcLec3重组蛋白的表达和纯化
设计一对编码FcLec3成熟肽的引物FcLec3mF (5'- TAC TCA GAA TTC GAA GTA GAG TAC TGT CCA TC -3')和 FcLec3mR (5'- TAC TCA GCG GCC GCC TAG TCG GTC CCG AGA TCC AC -3'),下划线分别为EcoRI和NotI酶切位点。采用该对引物扩增得到目的片段后，将其与己有的pET-30a(+)质粒分别进行双酶切，酶切体系为lO×H Buffer 2μL，BamHI 1μL, XhoI 1μL,片段/质粒10/6μL，补水至20μL。将酶切产物分别采用胶回收和PCR产物试剂盒进行回收。将回收后产物进行连接，连接体系为片段6.5μL ,载体2μL, T4 DNAligase 0.5μL, lO×ligation buffer 1μL, 16℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞阳性克隆筛选及确认同上。
将阳性菌株进行试表达。过程如下：过夜培养液以1: 100比例接入3 mL新鲜LB培养基(内含0.1 mg/mL卡那霉素)于37℃振荡培养3 h。取出少许菌液为对照，向剩余菌液中加入IPTG至终浓度为0.1、0.2、0.5和1 mM，置于37°C
和28°C继续振荡培养。将诱导前后的菌液离心，沉淀以磷酸盐缓冲液(PBS:140 mM NaCl, 2.7 mM KCl,10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH7.4)重悬，每100μL加入 5×SDS-PAGE Loading Buffer 30μL，10% SDS 溶液10μL和疏基乙醇10μL，沸水浴5 min处理。另外，将剩余重悬菌液加入Triton X-100至终浓度0.2%,于冰浴中超声破碎细胞，超声2s、间歇2s,全程3min，后于4°C 10,000 rpm离心10min将上清和沉淀样品分别处理。将所有样品进行12.5%SDS-PAGE电泳检测，选择较好的表达菌株和条件，确定蛋白表达的形式。将选定菌种于-80°C保存。
取过夜培养的活化菌液，以1: 100比例接入200 mL新鲜LB培养基(内含0.1 mg/mL卡那霉素),按己确定条件进行大规模表达及破碎细胞。将破碎后沉淀以 Buffer A (50 mM Tris-HCl，5 mM EDTA，pH 8.0 )和 Buffer B (50 mM Tris-HCl,5 mM EDTA，2M脲，pH 8.0)交替洗漆两次，洗漆条件为充分悬起振荡后于4°C 12,000 rpm离心20 min,去上清。将沉淀以buffer C (0.1 M NaH2P04，lOmM Tris-HCl，8M 脲，pH 8.0)充分悬起于37℃以 200 rpm 快速震荡1h。于4°C 12,000rpm离心20min，收集上清待纯化。
将适量蛋白样品缓慢流通己用buffer C平衡的亲和层析柱；再次加入10倍柱体积buffer C平衡；加入6倍柱体积的buffer D (0.1M NaH2PO4,10 mM Tris-HCl，8M脲，lOmM咪挫，pH8.0)洗涤非特异性结合蛋白；加入6倍柱体积的buffer E(0.1M NaH2PO4,10mM Tris-HCl，8M脲，0.25M咪唑，pH8.0)洗涤蛋白，分管收集并以Bradford法测定蛋白含量,进行电泳检测。
将纯化后蛋白样品于100倍体积透析液(0.1M Tris-HCl，5mM EDTA，5 mM L型半胱氨酸，10%甘油，pH8.0)中于4°C透析复性于16h，重复两次。将复性后样品于4°C 12,000 rpm离心20 min后以聚乙二醇20000浓缩蛋白，测定蛋白含量后，将蛋白样品分装储存于-80°C待用。
rMjLTL1和PET30A在大肠杆菌中重组表达与纯化
为了得到重组表达的rMjLTL1，我们用引物MjLTL1 ExF和 MjLTL1 ExR （分别含有Bam HI and Sal I酶切位点，Table1）进行PCR，扩增得到编码MjLTL1结构域的片段，用T4连接酶克隆到pET30a (+)（用Bam HI and Sal I进行双酶切并回收）原核表达载体上转化克隆菌株大肠杆菌DH5α，提取重组质粒pET30a-MjLTL1并转化表达菌株E. coli BL21 (DE3)。含有重组质粒的表达菌在37°C、0.4 mM IPTG进行诱导表达重组蛋白。经检测rMjLTL1是以包涵体的形式表达，纯化方法参考本实验室之前的方法(Du et al., 2006)。我们将空载体 PET30A (含有 His-tag) 转入E. coli BL21 (DE3)并进行诱导表达并纯化，诱导条件是0.4 mM IPTG、37 °C，纯化得到的蛋白用于做为对照。