实验九 维生素C的定量测定
【实验目的】
1. 学习定量测定维生素C的原理及方法 2. 掌握微量滴定法的操作技术 【实验原理】
维生素C具有很强的还原性，在中性和微酸性环境中，能将染料2，6-二氯酚靛酚还原成无色的还原型的2，6-二氯酚靛酚，同时被氧化成脱氢维生素C。氧化型的2，6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈现红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。当溶液由无色变为微红色时即表示溶液中的维生素C刚好全部被氧化，此时即为滴定终点。从滴定时2，6-二氯酚靛酚溶液的消耗量，可以计算出被检物质中还原型维生素C的含量。
【器材与试剂】
器材： 1. 研钵 2. 天平 3. 容量瓶（50ml） 4. 量筒 5. 刻度吸管 6. 锥形瓶（ 50ml）7. 玻棒 8. 微量滴定管 9. 漏斗 10. 新鲜蔬菜或新鲜水果 11. 滤纸 试剂： 1. 2%草酸溶液 2. 标准维生素C溶液 3. 0.02% 2，6-二氯酚靛酚溶液 【实验步骤】
1. 提取：称取新鲜样品约4g，臵于研钵中，加入5ml2%草酸溶液研磨成浆状，残渣再次研磨，一同转入50ml容量瓶中，草酸总量为35ml，加水定容。 2.过滤：提取液充分混匀后，过滤。
3. 样品滴定：准确吸取滤液5或10ml于50ml的锥形瓶中，立即用标定过的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至终点，粉红色，15秒不褪色。记录所用染料的毫升数（重复测定2～3次）。
4. 空白滴定：准确量取35ml2%的草酸，放入50ml容量瓶中，加水定容。准确吸5或10ml于50ml的锥形瓶中，立即用2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至终点，粉红色，15秒不褪色。记录所用染料的毫升数（重复测定2～3次）。 5. 计算 维生素C含量（mg/100g样品）=（V1-V2）VK/W）×100 式中：V1为滴定样品所耗用的染料的平均ml数 V2为滴定空白所耗用的染料的平均ml数
K为1ml染料相当于维生素C的mg数 W为样品质量g数
*标定2，6-二氯酚靛酚：取维生素C标准液5ml及1%草酸溶液5ml于50ml的锥形瓶中，用配制好的2，6-二氯酚靛酚溶液标定。 【实验结果与分析】 复习思考题、作业题：
1. VC理化性质最重要的是哪一点？为何用草酸来提取？
2. VC的生理功能（生化作用）有那些？
3. 为了准确测定维生素C的含量，实验过程中应注意哪些操作步骤？为什么？
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实验十 Folin-Wu法测定血液葡萄糖含量
一、目的
学会用Folin—Wu法测定血液中葡萄糖含量。 二、原理
葡萄糖的半缩醛羟基具有还原性，在加热条件下可使碱性铜试剂中的Cu2+
还原为黄色的氧化亚铜沉淀，而其本身被氧化为羧基。氧化亚铜可使磷钼酸还原成蓝色的钼蓝，蓝色的深度与葡萄糖的浓度成正比，故可用比色法测定钼蓝的光吸收值来测定葡萄糖的浓度。
3Cu2O + 2MoO3 → 6CuO + Mo2O3 (氧化亚铜) （钼蓝）
血糖即指血液中存在的葡萄糖。由于血液中成分复杂，尤其有许多种蛋白质存在，它们对血糖的测定会产生干扰。因此，目前常用钨酸法处理抗凝血来制备无蛋白滤液，然后用来测定无蛋白滤液中的葡萄糖含量。
Na2WO4 + H2SO4 → H2WO4 + Na2SO4 (钨酸钠) （钨酸）
在测定过程中，由于空气中的氧对Cu2O会产生再氧化作用从而影响测定结果，因此实验中要采用特制的福林—吴宪血糖管——有一细颈，可以尽量减少与空气的接触。（图23-1）
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图23-1 血糖管和奥氏吸管 1．（Folin-吴宪式）血糖管 2.奥氏吸管
三、材料、试剂和器具 （一）材料
饥饿16小时的鸡或兔 （二）试剂
1、草酸钾（A.R）
2、0.25%苯甲酸溶液 3、10%钨酸钠溶液
称取10g钨酸钠，用双蒸水溶解后定容至100ml。
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4、1/3mol/L硫酸溶液
5、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）
称取1.000g无水葡萄糖，用苯甲酸水溶液溶解后定容至1000ml，其浓度为1mg/ml。可长期保存使用。使用时用蒸馏水稀释，配成0.1mg/ml的葡萄糖溶液。
6、碱性铜试剂
分别称取40g无水碳酸钠、7.5g酒石酸、4.5g硫酸铜结晶，用蒸馏水溶解后混合，定容至1000ml。本试剂于室温下可长期保存使用，若有沉淀产生，应过滤后再使用。
7、磷钼酸试剂
称取70g钼酸、10g钨酸钠，量取10%氢氧化钠400ml及蒸馏水400ml，于烧杯中混合加热20~40min（以除去可能夹杂于钼酸中的氨），冷却后加入85%磷酸250ml，混匀后定溶至1000ml.. （三）器具
1、剪刀 2、烧杯
3、试管与试管架 4、玻璃棒
5、奥氏吸量管（见图23—1） 6、血糖管（见图23—1） 7、小漏斗 8、可见光分光光度计 9、水浴锅 10、移液管 11、电炉 12、天平 13、容量瓶
四、操作步骤
（一）制备无蛋白滤液
1．杀鸡取血后立即按2g草酸钾/L血液的比例加入草酸钾，以制备抗凝血。 2．于一支试管中加入7.5ml蒸馏水。
3．用奥氏吸管量取0.5ml抗凝血。小心擦去管外血液后，于试管底部缓缓放出血液。吸取试管内蒸馏水吹洗吸管数次后，充分摇匀，使血液完全溶血。注意不要使血液粘附于奥氏吸量管壁。
4．加入1/3mol/L硫酸1ml边加边摇，摇匀后放臵5min。 5．加入10%钨酸钠溶液1ml，边加边摇，摇匀后放臵5min. 6．过滤、收集滤液备用。若滤液不清，应重新过滤直至滤液澄清为止。至此，所制得的无蛋白滤液为20倍稀释的无蛋白血滤液，即每毫升血液相当于含血0.05ml..
(二)血糖的测定
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1．取血糖管3支，按下表进行编号后操作。 血糖管空白管 编号 试剂（ml） 蒸馏水 无蛋白血滤液 标准葡萄糖液 碱性铜溶液 磷钼酸试剂 蒸馏水 2.0 2.0 2.0 19.0 标准管 测定管 2.0 2.0 2.0 19.0 2.0 2.0 2.0 19.0 混匀，沸水浴中煮8min，勿摇动取出，流水冷却
2.充分混匀。
3．用分光光度比色测定吸光值A620nm。
（三）血糖浓度计算结果如下：
100测定管A620nm每100ml血液所含葡萄糖的毫克数=×标准葡萄糖的毫克数×
0.1标准管A620nm式中0.1表示2ml血滤液相当于0.1ml血液。
五、注意事项
1．过滤时应于漏斗上盖一表面皿，防止水分蒸发。 2．所用试管、漏斗均需干燥。
六、实验报告
以你的实验结果与其它测定血糖方法比较，有什么优缺点？
七、思考题
1．钨酸的作用是什么？
2．血糖管和奥氏吸管的结构特点对本实验有何作用？ 3、为什么实验中以无蛋白滤液，而不以全血、血浆或血清来测定血糖含量？
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实验十一 脂肪酸的β-氧化
目的和要求
1.了解脂肪酸的β-氧化作用。
2.通过测定和计算反应液内丁酸氧化生成丙酮的量，掌握测定β-氧化作用的方法及其原理 原理
根据β-氧化学说，机体组织能将脂肪酸氧化生成乙酰辅酶A。两分子乙酰辅酶A可再缩合成乙酰乙酸。在肝脏内，乙酰乙酸可脱羧生成丙酮，也可还原生成β-羟丁酸。乙酸乙酸、β-羟丁酸和丙酮总称为酮体。酮体为机体代谢的中间产物。在正常情况下，其产量甚微；患糖尿病或食用高脂肪膳食时，血中酮体含量增高，尿中也能出现酮体。
本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可用碘仿反应测定。在碱性的条件下，丙酮与碘生成碘仿。 操作方法
击毙动物（家兔、大鼠或豚鼠），迅速放血，取出肝脏，在玻璃皿上剪成碎糜。
取50毫升锥形瓶 2个，各加入 3毫升 Locke氏溶液和 2毫升 PH7．6的磷酸缓冲浪。在一个锥形瓶中，加入3毫升0.2N丁酸溶液，另一个锥形瓶作为对照。取约0.5克肝组织两份（相等重量），分别臵于两个锥形瓶内。混匀，于37℃恒温水浴内保温。
保温2小时后，取出锥形瓶，各加入2毫升15%三氯乙酸溶液，在对照瓶内追加3毫升0.2N 丁酸溶液。混匀，静臵 15分钟后过滤。分别吸取 5毫升滤波，放入另外两个锥形瓶中，再各加5毫升0．IN碘溶液和5毫升10%氢氧化钠溶液。摇匀后，静臵10分钟。加入5毫升10%盐酸溶液中和。然后，用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定剩余的碘。滴至浅黄色时，加入3滴淀粉溶液作指示剂。摇匀，并继续滴到蓝色消失。记录滴定样品与对照所用的硫代硫酸钠的毫升教，并按下式计算样品中丙酮含量：
样品中丙酮含量??B?A??0.9667?105式和B为滴定对照实验所消耗的0.1N硫代硫酸钠溶液毫升教；A为滴定样品所消耗的0.1N硫代硫酸钠溶液毫升数：0.9667为1毫升0.1N硫代硫酸钠溶液所
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