原位杂交流程 卢朝晖 整理
以下是用含有cDNA的质粒酶切出DNA片段标记探针，对石蜡切片进行mRNA检测的流程图。这些实验操作方法很多参考书中均有，但没有一本书是专为这个目的而系统地加以总结的，因此特加以综合供同行参考，在具体操作过程中很多地方可酌情变更。 在临床应用中，常常可以买到已经标记好的商品探针，那么前面一大部分扩增基因、酶切鉴定、标记探针的工作就可以省去，从石蜡切片处理做起即可。 下面介绍的方法笔者已亲手做过数次，可获满意结果。 主要操作步骤： 制备感受态细菌
用含目的基因的质粒转化细菌 小量培养转化的细菌 小量提取质粒 小量酶切质粒 电泳鉴定
大量培养转化的细菌 大量提取质粒 大量酶切质粒
电泳分离、回收及纯化 标记探针
石蜡切片的处理 预杂交、杂交 杂交后处理
抗体连接、显色
制备感受态细菌
【试剂及配制】 1．LB液体培养基
在900ml三蒸水中加入： 胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(bacto-extract) 5g NaCl 10g
磁力搅拌使完全溶解，用5mol NaOH调节pH至7.0（如用进口试剂则不必调）。定容为1000ml，高压灭菌20min。 2．0.1mol CaCl2溶液：
1.1g无水氯化钙，溶于90ml三蒸水中，定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌置于灭菌试剂瓶中，4℃保存。
【材料】
大肠杆菌单菌落或冻存菌种，也可复苏陈旧的感受态细菌重新制备新的感受态。
【操作方法】
1．从37℃培养12～16h的平板中用无菌的接种环（用前酒精灯烧红晾凉）挑一单菌落，转入含有5ml LB培养基的无菌试管，37℃振摇 （200r/min）过夜。次日取菌液1ml加入含100ml LB培养基的500ml 锥形烧瓶，37℃振摇培养（200～300r/min）约2～3h，将烧瓶取出立即置冰浴10～15min；
2．以下均为无菌操作。在超静工作台中将细菌转移到一个灭过的冰预冷50ml离心管中；
3．4℃离心，5000g × 10min，回收细菌；
4．弃去培养液，将管倒置于滤纸上1min，流尽培养液；
5．用冰预冷的0.1mol CaCl2 10ml 重悬菌体，置冰浴30min； 6．4℃离心，5000g × 10min，弃上清，倒置于滤纸上1min； 7．加4ml 用冰预冷的0.1mol CaCl2 ，重悬菌体，动作要轻； 8．置4℃冰箱12～24h，即可用于转化。
感受态细菌的冻存
一次制备的感受态不能用完，可冻存起来备用。将甘油装1.5ml EP 管中，沸水浴10min以杀菌。将感受态细菌分装成400μm一份，每份加30%体积的甘油，充分混匀，置-70℃冰箱，一年内可使用。
用含目的基因的质粒转化细菌
【试剂及配制】 1．LB液体培养基
2．氨苄青霉素（Amp）选择性培养基 LB培养基中加入1.5%的琼脂（15g/L），高压灭菌20min，取出，在无菌条件下，冷却至50℃左右时（烧手但尚可忍受）加入抗生素或其他必需成分，如为氨苄青霉素（Amp）选择性培养基，则以50mg/ml的氨苄青霉素贮存液按50μg/ml的量加入，即每ml培养基加入1μl氨基苄。 3．氨苄贮存液
将氨苄青霉素钠溶于三蒸水，配成50mg/ml溶液，以0.22μm滤纸过滤，1ml一份分装，存于-20℃。
【操作方法】
1．无菌状态下取新鲜感受态200μl置于无菌的10ml玻璃试管中。如果使用冻存的感受态细菌时，将其从-70℃冰箱取出，握于手中，待其解冻后立即吸取200μl 转移至10ml无菌玻璃试管中，剩余的感受态弃去，不能再冻存复用；
2．每管加质粒50～100ng，轻轻旋转以混合内容物，在冰上放置30min； 3．42℃ 水浴热休克90s，不要摇动试管；
4．每管加无抗生素的LB培养基1ml，37℃摇床温和摇振（100～150r/min）45min； 5．用无菌的弯头玻璃铺菌器（用前酒精灯烧，再晾凉）将200μl菌液铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃放置20min，然后倒置培养14～20h（37℃）。
小量培养转化的细菌
【操作方法】
1．取灭菌处理的10ml 玻璃试管，用无菌吸管加入约5ml LB液体培养基，再加入50mg/ml 氨苄青霉素5μl；
2．用接种环或无菌牙签挑取单菌落，送入培养液中，晃动使细菌进入培养液，封好管口；
3．37℃摇床100～200r/min，约6～12h，可过夜，使生长饱和。
质粒的少量提取
【试剂及配制】 1．溶液Ⅰ
葡萄糖（C6H12O6·H2O） 1.982g 三蒸水 160ml
0.5mol EDTA pH8.0 4ml 1mol Tris-Cl pH8.0 5ml
以三蒸水定容至200ml，高压灭菌，4℃保存 0.5 mol EDTA pH8.0 的配制： Na2EDTA·H2O 186.1g （如无水，则为175g） 三蒸水 700ml
边磁力搅拌边加入固体NaOH，缓慢少量加入，待充分溶解，pH接近8.0，用酸度计调节pH8.0 （HCl/NaOH）；
1mol Tris-Cl pH8.0 的配制： Tris 碱 121g 三蒸水 800ml
充分搅拌，用浓盐酸将pH调节至8.0，酸度计测量； 2．溶液Ⅱ
配制50ml的量，现用现配。 10 mol NaOH 1ml 三蒸水 40ml 10% SDS 5ml
用三蒸水定容至50ml 10mol NaOH 的配制：
40g NaOH晶体加三蒸水至100ml； 10% SDS 的配制：
戴口罩，称10g SDS，溶于80ml三蒸水中，68℃助溶，加数滴1mol HCl，调pH7.2，定容至100ml；
1mol HCl 的配制：
于通风橱中，三蒸水91.4ml，浓盐酸8.6ml，混匀； 3．溶液Ⅲ
5mol 乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml 三蒸水 28.5ml
高压灭菌，4℃保存； 5mol 乙酸钾配制：200ml 乙酸钾 98.14g 三蒸水 160ml
搅拌溶解，定容至200ml;
4．3ml 乙酸钠（NaAc）pH5.2 配制：500ml
乙酸钠（CH3COONa·H2O） 201.1g 三蒸水 200ml
用冰乙酸调节pH为5.2，三蒸水定容至500ml，高压灭菌，4℃保存。 5．平衡酚
在粗酚中加入0.1% 8-巯基喹啉，然后倒入0.1mol Tris-Cl pH8.0，避光磁力搅拌4h，静置后移去水相，再加0.1mol Tris-Cl pH8.0，搅拌、去除水相，反复进行，直到水相pH>7.8时为止，装棕色瓶，4℃保存。 6．TE 缓冲液 pH8.0
配制最终使：10mmol Tris-Cl pH8.0 1mmol EDTA pH8.0
7．其它试剂：氯仿：乙戊醇（V/V=24：1）、无水乙醇、70%乙醇
【操作方法】
1．取1ml菌液置于1.5ml的EP管中，10000g×30s 离心； 2．控尽上清液；
3．加溶液Ⅰ 100μl，重悬菌体；
4．加溶液Ⅱ 200μl ，倒转均匀； 5．加溶液Ⅲ 150μl ，混匀； 6．10000g×5min 离心； 7．转移上清至另一EP管；
8．加等体积平衡酚混匀，室温离心，8000g×5min；
9．小心吸取上清，转移至另一EP管中，勿将酚层吸出； 10．重复8、9的步骤；
11．等体积氯仿：乙戊醇，混匀； 12．离心，8000g×5min； 13．转移上清至另一EP管；
14．加1/10体积3mol NaAc pH5.2 和2.5倍体积的无水乙醇，混匀； 15．置液氮10min 或-20℃冰箱1h； 16．离心，10000g×10min；
17．弃上清，留沉淀，70%乙醇洗一次； 18．离心，10000g×10min； 19．弃上清，留沉淀，晾干；
20．加TE pH8.0 50μl ，溶解沉淀；
21．加RNase A (10mg/ml) 3～5μl 混匀，稍离心； 22．37℃ 水浴30 min； 23．-20℃ 保存待用。
小量酶切质粒
鉴定常用20μl反应体系。
【操作方法】
1．在灭菌的新EP管中加入7μl三蒸水； 2．加入10×缓冲液2μl ； 3．加限制酶5μl ；
4．最后加入质粒DNA10μl ； 5．稍离心，混匀； 6．37℃水浴1～1.5h；
7．无水乙醇沉淀（2.5倍体积无水乙醇，混匀液氮10min或-20℃ 30min，离心）； 8．弃上清，晾干，加10μl TE，建立第二个酶切体系，37℃ 1～1.5h； 电泳鉴定