2.4荧光共振能量传递（FRET）
荧光共振能量传递现象是Perrin在20世纪初首先发现的，1948年，Foster创立了理论原理，指荧光能量供体与受体间通过偶极－偶极耦合作用转移能量的过程，这种能量的转移是非放射性的，产生FRET的条件主要有三个：（1）供体与受体间足够靠近（1～10 nm）；（2）供体的发射光谱与受体的激发光谱有一定的重叠；（3）给体与受体的偶极具一定的空间取向，这是偶极－偶极耦合作用的条件。
荧光共振能量传递因为要考虑到供体和受体之间的距离，所以经常用来研究分子间的相互作用，像蛋白质的相互作用，抗原抗体结合，受体与配体的结合，另外在膜反应、离子通道等方面的研究也有相应应用。将FRET荧光探针标记的肽链，加入到固体表面的双层膜中，通过荧光漂白恢复（FRAP）成像技术检测，为研究跨膜螺旋二聚作用提供一个新的方法。用FRET标记细胞质，应用时间分辨技术，检测其对P2X离子通道的门控作用。
利用Eu等长效荧光物质作为供体，来进行荧光共振能量传递，在激发光熄灭后受体仍能较长的能量衰减时间，能量传递效率更高，可检测的相互作用距离更长，可达到100-200nm，时间延迟检测，降低了背景噪音，提高了灵敏度。
3. 小结
荧光法灵敏、准确、兼容性强、可以利用荧光分子对目标物质进行特异性标记大大减少杂质的信号干扰，荧光特性参数多，动态线性范围宽、可以活细胞活活体检测，灵敏度比分
光光度法高2～4个数量级，对微量和痕量药物进行灵敏准确的检测具有较大的优越性。总之，荧光法作
1、酶标仪原理
狭义的酶标仪是专门用于对酶联免疫吸附剂进行测定的特定分光光度计。较之普通分光光度计，其特点在于：1、专用聚乙烯微孔板作为抗原或抗体的固相载体；2、高通量测定，使用垂直光路而非水平光路；3、具备激发光源和检测器，可针对荧光基团或是化学发光基团做高通量检测。
2、分光光度计与酶标仪的区别比较
分光光度计和酶标仪都是实验室常用的两种仪器，它们的测定原理是相同的，都是使用朗伯-比耳定律，测定的都是样本的吸光度。
酶标仪按照功能的不同划分,可以分为（1）光吸收酶标仪（可见酶标仪，紫外/可见酶标仪）（2）荧光酶标仪（3）化学发光酶标仪。
分光光度计按照波长及应用领域的不同可以分为：（1）可见光分光光度计（2）紫外分光光度计（3）红外分光光度计（4）荧光分光光度计（5）原子吸收分光光度计。
分光光度计和酶标板存在一些不同之处，具体差别体现在以下三个方面： （1）盛装待测溶液的容器：
分光光度计用的是比色皿，酶标仪使用的是塑料微孔板(酶标板)。比色皿只能起到盛装溶液的作用，每个比色皿一次只能盛装一种溶液。酶标板常用透明的聚乙烯材料制成，对抗原抗体有较强的吸附作用，因此用它作为固相载体，酶标板通常为48孔或96孔，每个微孔可以盛装不同的溶液。
（2）光路的方向：
分光光度计是水平光路，而酶标仪则是垂直光路。由于酶标板盛样本的塑料微孔板是多排多孔的,光线只能垂直穿过,因此酶标仪的光束都是垂直通过待测溶液和微孔板的,光束既可是从上到下,也可以是从下到上穿过比色液。垂直光的特点是标本吸光度受液体浓缩或
稀释的影响小，不足之处是受被测样本液面是否水平、酶标板透光性、孔底是否平整等的影响较大。
（3）光路的长度：
由于光密度（OD值）与吸光系数, 待测组分的浓度以及光路长度成正比关系。 分光光度计采用的比色杯的宽度通常是1cm，所以光路长度固定为1cm。因此不同仪器，不同批次测量的数据具有同样的可比性。
而酶标仪采用的是垂直光路, 所以光路的长度应该是液体液面的高度。所以测得的值受到样品的体积的影响。 【资料】正确地认识和使用酶标仪
作为微孔板比色计的酶标仪，其基本功能不外乎一个比色测定，所不同的是在测定波长范围、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量测定软件功能等方面的差异，当然全自动酶免疫分析系统还具有自动洗板、温育、加样等功能。在临床实验室实际工作中，实验人员在使用酶标仪进行测定操作时，有时难免会对酶标仪的一些性能指标产生迷惑，甚至对酶标仪的应用产生错误的理解。如诸如使用酶标仪较用肉眼观察测定的阳性率明显增加这样的问题。 一、测定波长
一般酶标仪的测定波长在400～750nm或800nm之间，完全可以满足ELISA的显色测定。目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)，其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为2，2，—二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。当pH值为5．0左右时，DAB在450nm波长处有最大吸收，当pH值降为L 0时，最大吸收波长移至492 nm，同时摩尔消光系数变
大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有最大消光系数，如果HRP量少，H：O：和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min。因此，450nm和492 nm两个波长是目前ELISA测定最常用的。各种酶标仪都配有放置滤光片的可自动转换的部件，可以同时安装6～8片滤光片，所配备的滤光片均应包括上述两个波长，有的酶标仪以490nm滤光片替代492nm滤光片，影响不大。除了这两个基本滤光片外，考虑到双波长比色的需要，还应有620nm或630nm或650nm和405nm波长的滤光片，其他滤光片可根据自己的需要选择。有时，有的实验室希望用酶标仪作微量生化测定，故酶标仪生产厂家对其生产的酶标仪扩展了紫外检测功能，此时需要一个340 nm波长滤光片。此时，酶标仪的测定波长范围就成为340—750nm或800nm。 酶标仪有单波长和双波长检测功能有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具最大吸收的波长即450 nm或492 nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630 nm进行测定，酶标仪最后打印出来的吸光度则为二者之差。630 nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板孑L上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，最好使用双波长，且不必设空白孔。 二、测定的吸光度范围
通常，酶标仪的吸光度测定范围在0～2.5之间即可以满足ELISA的测定要求。早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0～2.5之间，但现在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。如Labsystems公司Dragon Wellscan MK—2的吸光度测定范围为0—3.5，而Multiskan Ascent的吸光度测定范围(Abs)达0～4．0，在0～4．0范围，线性误差不超过±2．0％，在0．3—3．0吸光度范围内，测定精密度CV小于±0．2％；