2．在照明充分的情况下，在显微镜视野内可看清洋葱鳞茎表皮细胞无色的细胞壁，但看不清液泡，为了能显示细胞质与液泡的界面，此时应
A 改用凹面反光镜，放大光圈 B 改用凹面反光镜，缩小光圈 C 改用平面反光镜，放大光圈 D 改用平面反光镜，缩小光圈
3．在显微镜视野中观察玻片标本，物镜测微尺和目镜（5X）测微尺在0点处重合时，物境测微尺的80格与目镜测微尺的55格处也相重叠时，试问目镜测微尺一格的长度是 μm；如观察测量某种植物的细胞大小时，测量其长为7个小格，那么此细胞的实际长度是 μm。
4．撕取所给叶片的下表皮，放在显微镜下观察，绘出保卫细胞及表皮细胞的特征。随机取五个视野计算气孔数，取其平均值，计算气孔密度（个／cm2）。（低倍物镜视野直径为1.5mm，目镜统一用10倍）
第二节 物理学和化学分析技术
【知识概要】 －、分离技术
分离技术主要是利用物理学和化学的原理建立起来的各种分离、纯化方法。常用的分离技术有以下几种：
1．纸层析法
层析技术是从一个混合物中分离和纯化一种或几种生物化合物的最简便的方法，用滤纸为支持物的层析法，叫纸层析法。
纸层析用的展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是静止相，纸是静止相的支持物，有机溶剂是流动相，它沿着滤纸流动。若将生物样品（提取液）点在滤纸上（此点称为原点）进行展层，样品中的各种溶质（如叶绿体中的四种色素，各种氨基酸等）即在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同溶质随流动相移动的速率不等，于是就将这些溶质分离开来，形成距原点不等的层析点。
纸层析的具体方法：（1）制样。将样品经研磨、过滤制备成提取液；（2）制备滤纸条。将滤纸剪成长10cm、宽1cm的纸条。在一端用铅笔画一横线（点样线）；（3）点样。用毛细吸管将滤液沿点样线画一直的滤液细线；（4）层析：将层析液（石油醚、丙酮、苯的混合液）倒入烧杯，然后将滤纸条靠烧杯内壁轻轻插入层析液中。（5）结果。几分钟后，出现层析现象。
2．电泳法
电泳技术主要是根据不同物质所带的电荷的数量和性质不同，因而在电场移动中的速度和方向就不同。生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、酶和核酸等都具有可电离的集团，在溶剂中能形成带电荷的分子，由于在不同的溶剂介质中所带的电荷的数量和性质的差别，在电场中泳动的速度（迁移率）不同，由此可以分离各种物质成分。电泳的方法很多，有纸电泳、琼脂平板电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，其中较简单的是纸上电泳法，它是用滤纸作为电泳载体的一种电泳方法。
纸上电泳一般操作过程（以分离血清蛋白为例）：（1）仪器准备。电泳设备主要是
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电泳仪和电泳槽（见下图）。电泳槽是供两极电泳分离和盛装缓冲液之用。电泳仪提供可控电源。一般采用电压在100～500V，电流在0mA～50mA或100mA。（2）配制缓冲液。缓冲液的种类很多，可用0.5M、pH5.6巴比妥缓冲液或 Ph8.6硼酸缓冲液。缓冲液配好后直接加入两侧电泳槽中。（3）裁剪滤纸。取电泳滤纸，按2×20cm剪裁，于一端约1/3处用铅笔划点样线，将纸用缓冲液浸湿。（4）点样。在点样线上，用50μL微量注射器点样，一般为10mL。点样后，将滤纸放在电泳槽两极隔板上，两端浸入缓冲液中。（5）电泳。接上电源，按滤纸长和宽选用电压（8V／cm）和电流（0.4mA／cm），以点样线一侧为负极，向正极泳行。（6）烘干。取下电泳纸条在烤箱（90℃～105℃）迅速烘干。（7）染色。将烘干滤纸条浸入溴酚兰染液10min，取出以0.5％醋酸溶液脱色，逐渐显出电泳带。（8）比色。将各条区带滤纸剪下，以电泳空白滤纸为对照，在分光光比色计上比色。（9）计算。按光密度值计算出各部分蛋白质的百分数。
水平电泳槽装置
3．离心法
离心法是一种利用物质在溶液中的密度、大小和形状的不同，以及它们沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别，通过强离心力的作用使其分离、浓缩、提纯的技术，并可用于分子量的测定。在生物学研究中，常用离心方法从组织匀浆中分离各种细胞器及各种蛋白质、核酸等生物大分子。
离心的设备主要是离心机，它是利用离心力对混合液进行分离和沉淀的专门仪器。离心机的种类很多，有低速离心机（4000γ/ min以下）、高速离心机（4000γ/ min以上，20000γ/ min以下）和超速高心机（20000γ/ min以上）。
离心分离方法很多，常用的是差速离心机，是指低速和高速离心交替进行，用不同强度的离心力使不同质量的物质分批分离的方法。例如，利用离心机的不同转数（rpm，即γ/ min）和时间，从鼠肝匀浆中分离各种亚细胞组分的过程（下图）：
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大白鼠肝脏匀装分级分离各种亚细胞组分图解
二、测定技术
1．定性测定——比色法
生物材料化学成分的测定技术很多，在生物学实验中最常用的简便方法是比色法。 比色法是利用生物组织中的有机物与某些化学试剂相互作用，能产生颜色反应的原理，可以根据颜色反应鉴定生物组织中某种有机物的存在。
从细胞组织中，鉴定有机物的常用比色法，参见下表。 成分 还原糖 蛋白质 淀粉 脂肪 维生素A 维生素B1 核酸 试剂 斐林（Fehling）试剂 双缩脲试剂 碘液 苏丹Ⅲ酒精溶液 三氯化锑一氯仿溶液 亚硫酸复红溶液 作用 使自由醛或酮基的糖氧化 肽锭在碱性环境中与CuSO4结合 淀粉与碘结合 脂肪与苏丹Ⅲ结合 与SbCl3作用 与DNA发生作用 颜色反应 产生棕红色Cu2O沉淀 产生红紫色的络合物 蓝色反应 红色反应 蓝色反应 红色反应 呈红色或紫色 重氮化氨基苯磺酸溶液 在碱性溶液中发生作用 2．定量测定——滴定法
滴定法是将一定浓度的标准溶液滴入被测物质溶液中，当反应到终点后，根据所用标准溶液的体积计算被测物质的含量，这是一种常用的容量分析法。
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滴定法常用的仪器是滴定管。它是带有刻度和活栓的玻璃管，用它放送已知体积的溶液。
滴定法的一般操作技术（以维生素C定量测定为例）：（1）样品制备。将样品（洗净蔬菜）20g，加2％草酸100g，置组织搅拌机中打成浆状。称取5g浆状物倒入50mL容量瓶中以2％草酸溶液稀释至刻度。静置10min，过滤备用。（2）滴定。①标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸（Vc）溶液 1mL（含0.1mgVc）置100mL锥形瓶中，加9Ml1％草酸，微量滴定管以0.1％2，6-二氯酚靛酚滴至淡红色，并保持15sec即为终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少mg抗坏血酸。②样液滴定：准确吸取滤液两份，每份10mL分别放入两个100mL锥形瓶内，测定方法同前。③计算：
V×T / W×100＝100g样品中含抗坏血酸（Vc）mg数
式中：V＝滴定时所用去染料毫升数。T＝1mL染料能氧化Vc毫克数。W＝10mL样液相当于含样品之克数。
【解题指导】
例1 叶绿体中色素的提取和分离：
（1）提取和分离叶绿体的色素，可采用 方法。
（2）用毛细吸管在滤纸上划出滤液细线时，线条越细越好，这样可以避免 ，以便取得较好的 。
（3）叶绿体b为黄绿色，层折后的位置是在滤纸条的 。
（4）实验应尽量在通风处进行，实验后一定要将手洗净，这是因为 。 析 提取和分离叶绿体中的色素可采用纸层析法。在点样划线时，越细越好，这样可避免色素带之间部分重叠，以便取得较好的分离效果。层析后，滤纸条上自上而下有4条色素带。因为该实验使用了苯、丙酮等有毒化学药品，实验时应通风，实验后要洗手，确保安全。
例2 在鸡血DNA的粗提取与鉴定实验中，请回答：（1）为什么使用NaCl溶液离析DNA？（2）为什么使用乙醇纯化DNA？（3）为什么甲基绿能鉴定DNA？
析 DNA在NaCl溶液中有一定的溶解度，并随着NaCl溶液的溶度变化而改变。当NaCl的质量浓度为0.14M／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可促使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。DNA不溶于乙醇，但细胞中的某些物质可以溶于乙醇。利用这一原理，可以进一步取出较纯净的DNA。DNA遇甲基绿会被染成蓝绿色。因此，甲基绿可用作鉴定DNA的特定试剂。
例3 利用纸电泳法分离血清蛋白。已知血清蛋白中含有5种蛋白质，依分子量由小到大排列为清蛋白A、α1、α2、β、γ球蛋白。试问：
（1）电泳后，滤纸上出现几条区带？离点样线最远者是什么蛋白质？说明其原因。（2）欲计算各部分蛋白质的百分数，请说明计算方法。
析：电泳后，在滤纸上应出现5条区带，因为分子量小的蛋白质，电场中泳动的速度快，也就是迁移率大。因此，离点样线最远者为清蛋白A，依次是α1、α2、β、γ球蛋白。计算各蛋白质的百分数，可通过比色法测定，在分光光电比色计上对各条区带进行比色，波长在580nm～600nm，记录各自的光密度。然后按光密度总和T＝A＋α1＋α2＋β＋γ的各光密度值，计算出各部分蛋白质的百分数：
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清蛋白 A％＝A / T×100；球蛋白α1％＝α1 / T×100 其他蛋白质依次类推。 【巩固练习】
5．在实验台上有天平、100mL烧杯、培养皿（6个）、红墨水、I2-KI溶液、苏丹Ⅲ溶液、双缩脲试剂、显微镜、刀片、镊子、小麦种子、菜豆种子、蓖麻种子（将以上种子分出一半浸泡使部分种子刚好发芽，然后将每种种子浸泡过的和干燥的分别装于培养皿中）。试问：
（1）绘图说明培养皿中各种材料各部分的结构名称。 （2）测定各类种子萌发所需的吸水量（g水 / g种子），并写明实验过程。 （3）测定各类种子潜在的萌发率（％），并写明实验过程。 （4）各类种子贮存有机物有何特点？依据是什么？
6．研磨叶肉细胞后放入离心管中离心，细胞壁和核物质沉淀在管底，这些沉淀物为P1，上清液为S1。将S1倒入另一管离心，分离出椭球或球形颗粒P2和上清液S2。将S2再倒入另一离心管离心，分离出棒状的颗粒民P3和上清液S3。再将S3倒入另一离心管离心，分离出上清液S4和含粒状小体的沉淀物P4。而S4中只含有溶解于水的物质。（见下图）。
请在A～E中选正确答案填入下列各问中。
A P1 B P2 C P3 D P4 E S4 （1）合成蛋白质的结构存在于 。 （2）DNA含量最多的是 。
（3）含有将CO2和H2O合成C6H12O6的反应所需酶的是 。 （4）含有将葡萄糖分解成酒精的反应所需酶的是 。
7．用碘液、乙醇、苏丹Ⅲ溶液、盐酸液、氢氧化钠溶液、硫酸铜溶液、氯化钾溶液、醋酸洋红溶液、亚甲基蓝溶液、丙酮等药品，如何证明面粉团用纱布包起来在清水中搓洗后，纱布中的面筋是蛋白质？洗出来的白浆是淀粉？
8．将花盆横放在转盘上，若转盘以最大速度旋转时，花枝朝什么方向生长？并说明其原因？
9．用小刀将数十只萤火虫发光器割下，干燥后研成粉末状，取两等分分别装入两只小玻璃瓶中各加入少量的水，使之混合，可见到玻璃瓶中有淡黄色荧光出现，经过15min荧光消失。这时，再将ATP溶液加入其中一只玻璃瓶中，将葡萄糖溶液加入另一只玻璃瓶中，可观察到加ATP溶液的玻璃瓶中荧光出现，而加葡萄溶液的瓶中没有荧光出现。以上现象说明了（1） ；（2） ；（3） 。
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