第三节微生物培养技术
【知识概要】
一、培养基的制作技术
制作培养基是微生物实验的基础。培养基的制作有以下几个环节： 1．玻璃器皿的清洁
在制作培养基前，首先应准备好合乎要求的清洁玻璃器皿。一般用肥皂液煮沸30min，或浸入用重铬酸钾和浓硫酸配制的洗液数10min，然后用清水冲洗，晾干后保存备用。
2．培养基的制作过程
（1）配制液体培养基 ①根据需要配制培养基的数量，先在大杯中注入部分蒸馏水；②按培养基配方称量各种成分的原料，依次加入使之溶解；③补足需水量；④如用肉膏等配制时，需加热溶解；⑤加热后，补足因加热所蒸发的水分，即成液体培养基。
（2）配制固定培养基 在液体培养基里加凝固材料（琼脂），加入后继续加热使之融化，即成固体培养基。
（3）调整 pH值 配好培养基后用pH试纸测试，用10% HCl或10％NaOH调到所需的pH。
（4）过滤分装 用滤纸或纱布趁热过滤，将过滤液分装于试管中，其量约为试管的1/4～1/3（不要沾污管壁），塞上棉塞。
（5）灭菌 将分装好的培养基，经高压蒸汽灭菌30min，保存备用。 3．制平面或斜面培养基
在分装时，如装入培养皿则成平面培养基。欲制成斜面培养基，则将灭菌后的琼脂培养基，趁热倒入试管，盖上棉塞，并将试管摆放在小木条支架上，呈适当斜度（见下图），凝固后即成斜面培养基，可保存备用。
培养基的斜面摆法
4．细菌培养基的制法
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培养不同的微生物需制备不同的培养基。培养细菌主要用牛肉膏培养基（牛肉膏0.5g；蛋白胨1g；食盐0.5g；琼脂1.5g；水100mL）。制法是：按照配方先配好各种成分的培养液，加热使之充分溶解，并补足所失水分。调pH为7.4～7.8（灭菌后的pH为 7.2～7.6）。分装后灭菌，制成斜面，即成肉膏蛋白胨培养基。
二、分病菌技术
分离菌技术主要包括接种和稀释技术。微生物的各项实验操作均应在无菌条件下进行。
1．接种技术
（1）接种设备 接种时可在无菌操作箱（见下图）或超净工作台上操作。无此设备条件也可直接在酒精灯上操作。接种工具有接种环、接种针和接种钩。
无菌操作箱
1．通气孔；2．移动门；3．手孔
（2）接种的方法步骤 ①用品的消毒灭菌。接种箱和接种用品用紫外灯灭菌。双手用75％乙醇消毒。②采种。菌种由窗门放入，两手从袖套伸进接种箱，点燃酒精灯，用左手并排拿起有菌种的试管和培养试管，试管口靠近酒精灯火焰，旋松棉塞；右手的拇指和食指拿起接种环，放在火焰上烧红灭菌。③接种。用右手的中指、无名指和小指夹下两个棉塞，把两个试管口放在火焰上燎一下。把灭菌的接种环伸进菌种试管，挑取一点菌落，再插入培养基试管里，在培养基斜面上由管底向管口连续轻轻地划几道曲线，使菌落涂在培养基上。然后抽出接种环，将试管口再在火焰上燎一燎，塞上棉塞，连续操作使所有培养基试管都涂上菌落。（参看下图接种方法示意图）④保温培养。接种后，将试管放保温箱37℃恒温培养，3～4天后，在培养基上可以看到正在发育的菌落。
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接种方法示意图
1．接种环灭菌；2．采种；3．接种；4．试管口灭菌；5．装好棉塞
2．稀释技术
在自然界，微生物都是混杂生活在一起的，要想研究某种细菌，必须从混杂的细菌群体中分离得到一种细菌。这种纯培养分离菌种的方法很多，较简单的有稀释倒平皿法。这种方法是将待分离的材料作一系列稀释（如1︰10、1︰100、1︰1000、1︰10000?等），取不同稀释液各少许与已溶化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合，倾入灭过菌的培养皿中，待培养基凝固后，保温培养一定时间，即有菌落出现（如下图）。如果稀释得当，平皿中出现分散的单个菌落便可能由一个细菌繁殖而成，挑取此单个菌落或再重复以上操作数次，便可得到纯培养的菌株。
稀释倒平皿分离法
三、染色技术
鉴别细菌主要采用革兰氏染色法。按照细菌对这种染色反应的不同，分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。染色方法要点是：细菌先经草酸结晶紫染色处理，用媒染剂（碘液）处理后，再用酒精脱色，最后番红或沙黄复染。如果细菌不脱色不复染，呈
＋
紫色，称为革兰氏阳性细菌（用G表示），如芽孢杆菌、放线菌、酵母菌和多数球菌呈阳性反应；如果细菌被酒精脱色而被番红或沙黄复染成红色的称为革兰氏阴性细菌（用－
G表示），如大多数无芽孢杆菌和某些球菌、螺旋菌，呈阴性反应。
【解题指导】
例1 现提供以下实验条件：显微镜一台、革兰氏染色用具一套、血球计数板一套、吸管、小烧杯、天平、测微尺一套、试管、吸水纸、二甲苯、香柏油。请进行下列实验并回答问题。
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（1）请设计一实验来判断：成型颗粒样品A。
①该样品可能含有何种生物细胞？该成型颗粒样品A中生物细胞含量为多少？（个/g）
②若该成型颗粒全为生物细胞组成，试求出每个细胞的重量？
（要求写出实验过程、所用器材，测定的数据、计算公式、结果等）
（2）有材料C，请对其进行革兰氏染色。判断该细菌为何形态？染色结果如何？绘出该细胞的形态图？（要求同上）
析 （1）实验提供的样品A为市售干性活酵母。先将定量样品A用定量无菌水稀释成菌液，然后用革兰氏染色法鉴别该菌的类型并在显微镜下识别该菌的形态。实验结果呈革兰氏阳性反应，再根据形态说明该样品可能是酵母菌。通过显微测量，用血球计数板测定样品A的细胞含量（个/g）和每个细胞的重量（g／个）。（2）材料C为短杆菌。通过革兰氏染色后，在油镜下观察细胞的形态，并绘出该细胞的形态图。
例2 将10mL酵母液放在适宜温度下培养，并于不同时间内等量均匀取样4次，分别测定样品中酵母菌的数量和pH，结果如下表。请分析回答。
（1）表中样品的取样先后次序为 。
（2）对酵母菌而言，100mL该培养液的环境负荷量为 个。
（3）若第5次均匀取样时，样品中的酵母菌数量为760个/mm3。产生这一结果的原因是 。
析 （1）根据样品菌数，越在先菌数越少，由此取样顺序为2、4、1、3。（2）经过培养10mL培养液中有菌数1210个/mm3，环境负荷量应为1.21×107。（3）培养液中的营养物质不断被消耗，pH值减小，部分酵母菌因营养缺乏不适应而死亡并解体。
【巩固练习】
10．有材料A1和A2。A1为接种后经32℃培养10小时的样品；A2为接种同样菌种并经培养12h后的样品，假设接种后该菌种细胞即开始以指数生长（即1→2→4→8?2n，这里n表示细胞分裂的次数），请通过试验测定出该微生物分裂一次所需要的时间。（用G表示，单位为min）
要求：（1）判断该生物细胞是什么？（2）记录一些重要的测定数据并写出计算公式。（3）写出测定所需要的主要设备、器材。
注：材料为培养的啤酒酵母。
11．有某一浓度的细菌悬液B，若不用血球计数极，请用实验台上给出的材料C测出该细菌悬液的浓度。请在试卷上写出测定过程和测定的结果（B为细菌培养液，C为已知浓度的鸡血）。
12．有平板培养材料D。请对其进行革兰氏染色并指出形态及革兰氏染色结果。该
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材料是否有自主运动（真性运动）？如何简便判断？如能运动，请判断该菌鞭毛类型。（要求写出实验过程及结果）
第四节 植物解剖与生理测定技术
【知识概要】
一、植物解剖技术（见下表） 植物各种器官解剖与观察方法 名称 材料 洋葱或小麦根尖 解剖方法 压片法（纵剖面）、徒手切片法（横切面），显微镜下观察 1．取枝条插在红墨水中，叶片显红色后，用解剖刀横切和纵切，直接观察 2．徒手切片法，显微镜下观察 徒手切片法，显微镜下观察 用镊子分层解剖，将花的各部分摆在白纸上直接观察 用解剖刀将果实纵剖或横剖后，直接观察 观察顺序 表皮→外皮层→内皮层→中柱（中柱鞘、维管束） 总结 根结构特点 根 1．新生杨树枝条 2．玉米幼茎 茎 1．树皮→表皮→皮层→韧皮部（筛管）→木质部（导管）→髓 2．表皮→机械组织→维管束（导管、韧皮部） 双子叶木质茎构造特点单子叶草质茎构造特点 蚕豆叶或青菜叶 叶 桃花 玉米雌、雄花 上表皮→气孔→叶肉（栅栏组织、海绵组织）→叶脉→下表皮→气孔 叶结构特点 花 花萼（萼片数）→花冠（花单性花和两性瓣数）→雄蕊（花丝、花药）花结构特点，花→雌蕊（柱头、花柱、子房）图式 →花托 荚壳→果皮（外果皮、内果皮）→果肉→子房壁→种子→胎座 不同果实的结构特点 桃（核果） 果番茄（浆果） 实 蚕豆（角果） 苹果（梨果） 二、徒手切片技术 徒手切片是将要观察的材料切成极薄的片，以达到了解其形态结构的一种方法。徒手切片步骤如下：
1．选择材料和夹持物
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