山东农业大学硕士学位论文
山東農業大學 硕 士 学 位 论 文
放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初
步研究
Study on isolation and purification of the antibiotic substance from the fermentation broth of actinomycetes
strain Y23 and the primary its characteristics.
2010年4 月 29 日
目录
中文摘要 ............................................................................................................... 1 Abstract ................................................................................................................. 2
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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究
1 引言 ................................................................................................................... 4 1.1 烟草青枯病的发生与危害 ................................................................................. 4 1.2 病原与主要症状 ............................................................................................... 4 1.3 青枯病菌的致病机制 ........................................................................................ 5 1.3.1 青枯菌的运动性 ............................................................................................ 6 1.3.2 青枯菌胞外蛋白 ............................................................................................ 6 1.3.3 青枯菌的胞外多糖 ......................................................................................... 6 1.4烟草青枯病的发生发展规律 .............................................................................. 6 1.5 青枯病的防治方法............................................................................................ 7 1.5.1 药剂防治 ....................................................................................................... 7 1.5.2 生物防治 ....................................................................................................... 7 1.6 放线菌 ............................................................................................................. 8 1.7 利用放线菌开发抗生素的意义 .......................................................................... 9 1.8 放线菌的抗生作用机理................................................................................... 10 1.9 利用放线菌开发抗生素过程中存在的问题及解决途径 ..................................... 10 1.10 生物农药与农用抗生素的关系 .......................................................................11 1.11化学农药的问题和抗生素类农药具有的优点...................................................11 1.11.1 化学农药的问题 ..........................................................................................11 1.11.2 抗生素类农药具有的优点 ............................................................................11 1.12 国外农用抗生素的研究进展 ...........................................................................11 1.13 国内农用抗生素研究进展 ............................................................................. 13 1.14 农用抗生素的开发模型 ................................................................................. 14 1.14.1构建农用抗生素开发模型的必要性 ............................................................. 14 1.14.2 开发模型 ................................................................................................... 14 1.15 农用抗生素的分离纯化 ................................................................................. 15 1.15.1 农用抗生素的分离纯化特点 ....................................................................... 15 1.15.2 农用抗生素分离纯化技术........................................................................... 16 1.15.2.1 预处理和固液分离................................................................................... 16 1.15.2.2 提取(初步分离) ...................................................................................... 17 1.15.2.3 精制(高度纯化) ...................................................................................... 18 1.15.2.4 成品制作................................................................................................. 20 1.15.3农用抗生素分离纯化的发展趋势 ................................................................ 21 1.16 农用抗生素的发展前景 ................................................................................. 22 1.17 多糖 ............................................................................................................. 23 1.18本研究的立题依据和目的意义....................................................................... 24 2 材料与方法....................................................................................................... 25 2.1 材料............................................................................................................... 25 2.1.1 发酵菌株 ..................................................................................................... 25
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2.1.2供试病原菌.................................................................................................. 25 2.1.3 培养基 ........................................................................................................ 26 2.1.4 试剂 ............................................................................................................ 26 2.1.5 实验仪器 ..................................................................................................... 27 2.2 实验方法........................................................................................................ 27 2.2.1菌种发酵培养 .............................................................................................. 27 2.2.2 发酵液预处理 .............................................................................................. 27 2.2.3抑菌活性测定 .............................................................................................. 28 2.2.4发酵液抑菌活性的贮藏稳定性...................................................................... 28 2.2.5 发酵液抑菌活性的pH稳定性....................................................................... 28 2.2.6发酵液抑菌活性的热稳定性 ......................................................................... 29 2.2.7发酵液抑菌活性的光稳定性 ......................................................................... 29 2.2.7.1发酵液抑菌活性的紫外光稳定性................................................................ 29 2.2.7.2 发酵液抑菌活性的日光稳定性 ................................................................... 29 2.2.8有机溶剂对发酵液活性物质的萃取实验........................................................ 29 2.2.8.1 萃取剂的选择 ........................................................................................... 29 2.2.8.2 萃取比例的选择 ........................................................................................ 29 2.2.8.3 萃取次数的选择 ........................................................................................ 30 2.2.9 粗分离 ........................................................................................................ 30 2.2.10 硅胶柱色谱................................................................................................ 30 2.2.10.1 硅胶薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）对硅胶柱色谱起始洗脱条件的选择实验 ...................................................................................................... 30 2.2.10.1.1 薄板的制备 .......................................................................................... 30 2.2.10.1.2 样品制备 .............................................................................................. 30 2.2.10.1.3 展开系统的选择 ................................................................................... 30 2.2.10.1.4点样 ..................................................................................................... 31 2.2.10.1.5展开与检测........................................................................................... 31 2.2.10.2 硅胶柱色谱分离 ...................................................................................... 31 2.2.10.2.1 样品制备 .............................................................................................. 31 2.2.10.2.2 柱层析用硅胶的预处理 ......................................................................... 31 2.2.10.2.3 装柱与上样 .......................................................................................... 31 2.2.10.2.4 洗脱和产物处理 ................................................................................... 32 2.2.11 硅胶薄层色谱制备抑菌活性物质 ................................................................ 32 2.2.11.1 硅胶薄层色谱展层条件筛选..................................................................... 32 2.2.11.2 薄层色谱法制备抑菌活性物质 ................................................................. 32 2.2.12高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)检测活性物质的纯度 ............................................................................................................. 32 2.2.12.1样品处理 ................................................................................................. 32
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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究
2.2.12.2活性物质的全波长紫外检测 ..................................................................... 33 2.2.12.3 高效液相色谱洗脱条件筛选..................................................................... 33 2.2.12.4 高效液相色谱法检测纯度 ........................................................................ 33 2.2.13捷克八溶剂系统纸色谱 .............................................................................. 33 2.2.14 pH纸色谱 .................................................................................................. 34 2.2.15官能团反应试验 ......................................................................................... 34 3 结果与分析....................................................................................................... 34 3.1 抑菌活性测定................................................................................................. 34 3.2 Y23菌株发酵液的贮藏稳定性......................................................................... 37 3.3 Y23菌株发酵液的pH稳定性.......................................................................... 38 3.4 Y23菌株发酵液的热稳定性 ............................................................................ 38 3.5 Y23菌株发酵液的光稳定性 ............................................................................ 39 3.6有机溶剂对发酵液活性物质的萃取实验 .......................................................... 40 3.6.1萃取剂的选择 .............................................................................................. 40 3.6.2萃取比例的选择........................................................................................... 41 3.6.3 萃取次数的选择 .......................................................................................... 41 3.7硅胶柱色谱 .................................................................................................... 42 3.7.1硅胶柱色谱起始洗脱条件的确定 .................................................................. 42 3.7.2硅胶柱色谱分离........................................................................................... 43 3.8 硅胶薄层色谱制备抑菌活性物质..................................................................... 44 3.8.1 硅胶薄层色谱洗脱剂的筛选 ......................................................................... 44 3.8.2 抑菌活性物质的硅胶薄层色谱制备 .............................................................. 45 3.9高效液相色谱法检测活性物质的纯度 .............................................................. 47 3.9.1活性物质的全波长紫外检测 ......................................................................... 47 3.9.2高效液相色谱洗脱条件筛选 ......................................................................... 47 3.9.3高效液相色谱法检测纯度............................................................................. 49 3.10捷克八溶剂系统纸色谱及pH纸色谱 ............................................................. 49 3.11官能团反应试验............................................................................................ 50 4 结论与讨论....................................................................................................... 51 4.1抑菌试验 ........................................................................................................ 51 4.2发酵液预处理 ................................................................................................. 51 4.3发酵液的稳定性 ............................................................................................. 51 4.4发酵液活性物质的提取 ................................................................................... 52 4.5活性物质的分离纯化 ...................................................................................... 52 4.5活性物质的理化性质 ...................................................................................... 54 5参考文献 .......................................................................................................... 55 6附录 ................................................................................................................. 63 7致谢 ..................................................................................... 错误！未定义书签。
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中文摘要
烟草青枯病是由茄劳尔氏菌[Ralstonia solanacearum(E.F.Smith)]引起的一种细菌性病害，在国内的广东、福建等南方地区普遍发生。近几年来，该病的发生和危害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南及陕西等省均有发生，局部地区为害较重，已成为烟草主要病害之一。
本实验室从来源于山东临沂的烟田土样中筛选出一株放线菌菌株Y23，该菌株对烟草青枯病菌等多种植物病原菌有明显的抑制作用。本实验主要从菌株Y23发酵抑菌活性物质的稳定性、理化性质、分离提纯方法等几个方面进行研究：
1．分别采用抑制菌丝生长速率法和琼脂扩散法测定了 Y23菌株发酵液对15种病原真菌、3种病原细菌的抑菌活性。结果表明，Y23菌株发酵液对禾谷镰刀菌、苹果轮纹病菌、大麦条纹病菌的菌丝生长抑制率达55%以上，占供试真菌数的20%；琼脂扩散法生测结果表明，Y23菌株发酵液只对烟草青枯病菌有抑制作用。发酵液的稳定性测定结果表明，发酵液低温贮藏效果好，对热、酸碱及紫外光照稳定性较强，对日光照稳定性较差。
2．发酵液通过有机溶剂萃取实验，选择乙酸乙酯为适宜的萃取剂。经预处理、溶媒萃取等步骤后，采用硅胶柱色谱对活性物质进行分离。首先以硅胶薄层色谱初步筛选分离条件，在此基础上，进一步优化柱色谱条件：依次采用石油醚∶异丙醇为9∶1、7∶3、5∶5、2∶8洗脱，结果取得了较好的分离效果。最后采用硅胶薄板层析法，以石油醚∶异丙醇∶甲醇为10∶1∶0.5做展开剂薄层层析时，分离得到了1种对烟草青枯病菌有明显抑菌作用的活性物质。
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