山东农业大学硕士学位论文
剂有限公司）、乙酸（天津市凯通化学试剂有限公司）、六氢吡啶（天津市凯通化学试剂有限公司）、苯（天津市凯通化学试剂有限公司）、甲醇（天津市凯通化学试剂有限公司）、NaCl（天津市凯通化学试剂有限公司）、NaSO4（天津市德恩化学试剂有限公司）、Na2HPO4·2H2O（兖州化工厂）、柠檬酸（天津市永大化学试剂开发中心）、NaOH（济南天桥精细化学品公司）、无水CuSO4（天津市凯通化学试剂有限公司）。
2.1.5 实验仪器
SIGMA1-14型台式高速离心机、Eppendorf 5804R型台式冷冻离心、LRH-250生化培养箱、SPEG AIR TECH超净工作台、Agilent 1200型高效液相色谱仪、Heidolph4002型旋转蒸发仪、WD一9403C型紫外分析仪、 UV-2800型紫外可见光分光光度计、302型电热鼓风干燥箱。
2.2 实验方法
2.2.1菌种发酵培养
菌种斜面培养：无菌操作环境下，以接种环将菌株
Y23孢子涂布于
PDA斜面培养基上，27℃培养7天，保藏备用。
发酵培养：采用摇瓶发酵培养法。在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，接种量2%（V/V），摇床转速为200 r/min，发酵温度为26℃，发酵时间为96h。
2.2.2 发酵液预处理
将发酵液以10 000r/min的速度离心10min去除发酵液中的菌丝体等固体，取上清液，微孔滤膜（0.22μm）抽滤除去上清液中悬浮的细小杂质。
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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究
2.2.3抑菌活性测定
抑制生长速率法：取
Y23菌株发酵液15mL与150mL冷却到45℃的
PDA培养基迅速混匀，平均倒入10个无菌培养皿内，冷却后在每个培养皿平面放入1个供试菌的菌饼（直径为5mm）反接于培养皿中央（培养皿直径为90mm），置26℃培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次。采用十字交叉法测定菌落直径，计算抑制率(刘晓妹，2003)。
菌丝生长抑制率= （对照菌落直径–处理菌落直径） (对照菌落直径–5)×100 ⑴
琼脂扩散法 以董锡文等（2008）的方法为基础进行改进，取1mL细菌菌悬液（张薇等，2007）与150mL已融化冷却到45℃的PDA培养基迅速混匀，平均倒入10个无菌培养皿内，待培养基凝固后用打孔器（直径5mm）在每个培养皿内打孔两个，一个注入发酵液30μL，另一个以无菌水作对照，每个处理重复3次，取平均值。置于26℃的恒温箱中进行培养，24h后测量抑菌圈直径。
抑菌圈直径=测量值–5mm ⑵
2.2.4发酵液抑菌活性的贮藏稳定性
取发酵液50mL，平均分成两份，分别装入无菌的密封三角瓶中，分别在4℃冰箱和在室温条件下保存，在第3天、第7天、第15天、第30天测定抑菌生物活性，采用琼脂扩散法测定，试验重复3次，试验温度为室温，以烟草青枯菌为指示菌。
2.2.5 发酵液抑菌活性的pH稳定性
取30mL发酵液9份，用1mol/L的NaOH溶液和1mol/L的HCl溶液分别调pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0，2h后调回自然pH值（pH≈7），以未经处理的发酵上清液（pH≈7）为对照，用滤纸片法（徐叔云，2002）进行抑菌活性测定。试验重复3次，试验温度为室温，以烟草青枯菌为指示菌。
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2.2.6发酵液抑菌活性的热稳定性
取30mL发酵液，分别置于50℃、60℃、70℃、90℃、100℃下水浴中处理30min后，以未处理的发酵上清液为对照，以琼脂扩散法测定不同处理的发酵液的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径来确定其热稳定性，试验重复3次，试验温度为室温，以烟草青枯菌为指示菌。
2.2.7发酵液抑菌活性的光稳定性
2.2.7.1发酵液抑菌活性的紫外光稳定性
将发酵液置于无菌培养皿中，然后将盛满发酵液的培养皿放在距离紫外灯30cm的位置，打开紫外灯照射，在第1h、3h、6h、9h分别取1mL放入无菌试管中，以不作处理的发酵上清液为对照，以琼脂扩散法测定不同处理的发酵液的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径来确定其紫外光稳定性，试验重复3次，试验温度为室温，以烟草青枯菌为指示菌。 2.2.7.2 发酵液抑菌活性的日光稳定性
将发酵液置于无菌培养皿中，然后将盛满发酵液的培养皿放在日光下照射，在第1h、3h、6h、9h分别取1mL放入无菌试管中，以不作处理的发酵上清液为对照，以琼脂扩散法测定不同处理的发酵液的抑菌圈直径，根据抑菌圈直径来确定其日光稳定性，试验重复3次，试验温度为室温，以烟草青枯菌为指示菌。
2.2.8有机溶剂对发酵液活性物质的萃取实验
2.2.8.1 萃取剂的选择
取20mL发酵上清液5份，分别加入等体积石油醚、乙醚、苯、氯仿和乙酸乙酯，装在250mL三角瓶后封口放入摇床上震荡，转速为50r/min，温度为26℃，震荡2h，取出后放入分液漏斗静置分层1h，分别收集有机相和水相，以烟草青枯病菌为指示菌，以相应的有机溶剂为对照，测定各个有机相的抑菌活性，试验重复3次。 2.2.8.2 萃取比例的选择
取
6份乙酸乙酯各20mL，分别与体积为5mL、10mL、20mL、
40mL、60mL和80mL的发酵上清液混合后装入250mL三角瓶后封口放入摇床上震荡，转速为60r/min，温度为26℃，震荡1h，取出后放入分
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放线菌菌株Y23活性物质的分离纯化及理化性质的初步研究
液漏斗静置待其分层，分别收集有机相和水相，以烟草青枯病菌为指示菌，以有机溶剂为对照，测定各个有机相的抑菌活性，试验重复3次。 2.2.8.3 萃取次数的选择
取20mL发酵上清液5份，分别用等体积的乙酸乙酯萃取1-5次，取样进行抑菌活性检测，以烟草青枯病菌为指示菌，以有机溶剂作对照，试验重复3次。
2.2.9 粗分离
将发酵液滤液用乙酸乙酯萃取3次，合并后萃取液于43℃下减压蒸馏得到褐黄色油状物，用甲醇溶出，4℃冰箱储存待用。
2.2.10 硅胶柱色谱
2.2.10.1 硅胶薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）对硅胶柱色谱起始洗脱条件的选择实验 2.2.10.1.1 薄板的制备
称取
5gCMC—Na溶于1000mL蒸馏水中，加热搅拌使之溶解，制成
0.5%CMC—Na水溶液，再称取100g薄析硅胶G放入研钵中不断加入冷却后的上述CMC—Na溶液300mL，反复研磨成均匀的浆状物，取约10mL涂到20cm×10cm的玻璃板上，振荡铺平，自然风干。硅胶薄层厚度约为0.5mm。使用前将硅胶薄板置于烘箱中105℃下活化30min。 2.2.10.1.2 样品制备
将通过粗分离得到的褐黄色油状物与甲醇充分溶解，用于硅胶薄层色谱上样。
2.2.10.1.3 展开系统的选择
本实验对以下几种溶剂系统进行了测试(V/V)： ⑴ 石油醚∶异丙醇（18∶1） ⑵ 石油醚∶异丙醇（16∶1） ⑶ 石油醚∶异丙醇（14∶1） ⑷ 石油醚∶异丙醇（12∶1） ⑸ 石油醚∶异丙醇（10∶1） ⑹ 石油醚∶异丙醇（8∶1） ⑺ 石油醚∶异丙醇（6∶1）
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⑻ 石油醚∶异丙醇（4∶1） 2.2.10.1.4点样
采用带状点样，点样处距离薄板下沿2.0cm，多次点样，吹风机干燥样品配合点样，使样品固定在点样处。 2.2.10.1.5展开与检测
将配好的展层剂加入展层缸中，密闭60min让缸中气液两相达到饱和状态。然后将点样后的硅胶薄板放入展层缸中，上行展开，保持缸的气密性。当展层剂前沿距离薄板前沿约1cm时，展层结束。取出硅胶薄板，晾干。
在254nm紫外灯下进行检测，观察带的位置和彼此之间的距离，标记并计算出比移值Rf。同时采用生物鉴定法，将硅胶薄板上各条带轻轻刮下，用甲醇浸提，离心、有机滤膜（0.22μm）抽滤除去硅胶，取上清液进行抑菌活性检测，并以甲醇为对照。
Rf = 条带中心至点样带中心的距离
溶剂前沿至点样带中心的距离 ⑶
2.2.10.2 硅胶柱色谱分离 2.2.10.2.1 样品制备
用甲醇溶解待用样品。
2.2.10.2.2 柱层析用硅胶的预处理
将柱层析用硅胶，用石油醚∶异丙醇=9∶1（V/V）的混合液洗涤，除去杂质后将硅胶自然晾干，而后将硅胶放入鼓风干燥箱110℃下活化60min，冷却后上样备用。 2.2.10.2.3 装柱与上样
湿法装柱：称取200～300目柱层层析硅胶200g（处理过的），以石油醚∶异丙醇=9∶1（V/V）的混合液与之充分混匀，除去气泡，混合物成悬液状；将搅拌均匀的硅胶缓缓加入到规格为400mm×16mm的层析柱内，静置过夜，待柱子沉降完全后，再用石油醚∶异丙醇=9∶1（V/V）的混合液冲柱1h，将柱子压实备用。
干法上样：将样品的甲醇溶解液拌入柱层层析硅胶[试剂级(粒度：200～300目）]，挥发干溶剂后上样，上样时小心加入到准备好的硅胶柱体上部，使上样硅胶层表面平整。
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