组号:NO.2 总得分： 批改教师签字： 年 月 日
实验一 植物基因组总DNA的提取、纯化和鉴定
本实验得分： 批改教师签字： 2014年 6 月 30 日 一、实验目的
掌握CTAB法提取DNA的原理及方法 二、基本原理
植物材料在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁，游离出细胞器和原生质，并防止DNA降解。采用CTAB抽提液研磨物，在高盐条件下不但溶解细胞膜相物质，而且CTAB与核酸形成可溶性的复合物，采用离心可以将变性的蛋白质和多酚、多糖等杂质去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其他可溶性的杂质。直接向水相中加入异丙醇使核酸的沉淀，CTAB和其他多数杂质留于与水的混合相中，吸出核酸沉淀团经过多次乙醇漂洗和沉淀，TE溶解得到DNA粗提物。用RNase水解RNA，用酚：氯仿：异戊醇和氯仿抽提去除蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得高纯度的gDNA。 三、实验材料
甘蓝型油菜幼叶
四、主要仪器设备及耗材
低温离心机、微量移液器、恒温水浴锅、电泳仪及水平电泳槽、紫外透视成像仪等。 五、主要试剂
CTAB抽提液、NaAc（aq）、无水乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24：1）、RNase A(10μg/μl)等。 六、实验流程及步骤
（一）、DNA的粗提
1.向15ml离心管中预先加入5mlCTAB抽提液及0.1ml的巯基乙醇，混匀，65℃预热； 2.称取1.00g油菜幼叶用液氮研磨成粉末，迅速转入1.5ml离心管，迅速摇匀。 3.于65℃水浴45分钟，中途间隔轻柔颠倒混匀3-4次。 4.冷却后加入等体积（5ml）氯仿-异戊醇，轻柔颠倒混匀使乳化10分钟，10000rpm室温离心10分钟。 5.吸取上清于另一干净的15ml离心管中。
6.加入与上清液等体积约（5ml）的异丙醇，颠倒混匀，约1-2分钟后应有白色絮状沉淀出现。 7.将沉淀团移入盛有1ml75%乙醇的离心管中，若沉淀少，则于4℃、1000rpm离心3分钟收集沉淀DNA。 8.在75%乙醇中漂洗沉淀DAN数次，用枪头吸干乙醇。 9.用0.5ml75%乙醇在漂洗2次，连续洗四遍，。 10.无水乙醇再漂洗1次。
11.沉淀于室温或37℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现透明状，不要过度干燥。 12.用500ulTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，DNA粗体物可用于粗略PCR等。 （二）、DNA的纯化
1.向TE溶解的DNA粗体物中加入4-10ulRNaseA,约（40-100ug）,轻柔混匀。 2.于65℃酶解RNA 2.5小时，RNA酶分两次加入，每次4ul。
3.加入500μl酚/氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀使乳化10min，颠倒1-2min，静置4-5min，重复3次； 5.加入500μl氯仿/异戊醇轻轻颠倒乳化10min；同3
7.向上清中加入1/10体积的醋酸钠溶液，并加入2.5倍体积异丙醇，冰浴沉淀30min； 9.沉淀用75％乙醇500μl漂洗多次；之后用无水乙醇漂洗一次； 七、实验结果与分析
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图1 油菜基因组纯化DNA电泳 粗提时DNA清晰抱团，量多，较成功。
纯化DNA电泳条带较暗,没有第五组亮，可能的原因为研磨样品后转管过程中冷粉在管口有少许解冻。 核酸蛋白测定仪测得DNA原液浓度为0.448ug/ul；总DNA重量89.6ug；抽提得率0.0000896；OD260/OD280=1.02<1.8（可能是因为酚/氯仿/异戊醇变质氧化成粉色而效果不佳，使蛋白质去除不彻底）； OD260/OD230 =0.542<1.8（可能是因为乙醇清洗不彻底）
八、讨论
1．在DNA粗提过程中，CTAB应注意提前在65℃水浴中预热，有助于DNA的抽提；在材料研磨过程中应注意研磨破碎，快速转管，防止材料解冻；基因组DNA一般比较大，为防止断裂，应避免剧烈震荡。
2.在 DNA纯化过程中，出现白色凝胶状，其原因可能是材料含糖量过高，导致其在电泳过程中与DNA吸附在一起，无法跑出条带，在65℃酶解RNA 时间可以适当延长，保证RNA彻底降解。造成纯化失败的原因包括以下几个因素：植物材料多糖含量较高，与DNA粘附在一起，停留在点样孔；在DNA粗提过程中可能由于酚：氯仿：异戊醇试剂出现质量问题，导致纯化失败；粗提的DNA应选择P H8.0以上的TE溶解，使DNA在碱性条件下保存。
3．磨样转管过程不能升温解冻，一直保持冷粉状态。
实验二 目标基因的PCR扩增、电泳鉴定和胶回收
本实验得分： 批改教师签字： 2014 年 7 月 1 日 一、实验目的
掌握回收DNA片段的方法和学会相关的操作及原理 二、基本原理
DNA在94℃高温下变性成单链，降温退火过程中一对引物分别与两条模板单链的对应区段发生互补结合，在72℃下Taq DNA聚合酶催化引物引导的新链DNA的合成。延伸的产物又可作为下一次循环反应的模板，用于指导下一级DNA新链的合成，如此多次循环，将原有模板中的的特异DNA片段发生几乎为指数级的增加。经电泳分离的目的条带，切取琼脂凝胶回收并按试剂盒操作纯化目标片段DNA。 三、实验材料
甘蓝型油菜gDNA 四、主要仪器设备及耗材
PCR仪、离心机、冰箱、双稳定时电泳仪及水平电泳槽、紫外透视成像仪、微量移液器等。 五、主要试剂（盒）
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EasyTaq酶，PCR buffer(含氯化镁），dNTPS(10mmol/L),重蒸水，单蒸水，矿物油，琼脂糖，6×上样缓冲液，Trans2K Plus DNA marker，GoldView 核酸染料贮存液，1×TAE缓冲液，胶回收试剂盒和BnCHS1基因全编码区扩增引物。 六、实验步骤
（一）、PCR扩增与检测
在一个0.2ml的离心管（PCR管）中配置一个50μl的PCR反应体系，其中包括：
ddH2O 40.5μl 10×PCR buffer 5μl 10mmol/L dNTP 1μl 10μmol/L FCHSA 1μl 10μmol/L RCHS 1μl 甘蓝型油菜基因组DNA 1μl Taq DNA聚合酶（5U/μl） 0.5μl
总体积 50μl
七、实验结果与分析
1. 利用实验一提取出来的本组DNA和实验室提供的DNA引物进行PCR扩增，经过电泳检测发现第一
个失败，未扩出条带，第二个在长度1.3kb处有一条清晰的带。
图2.1 PCR电泳图
2. 将凝胶上的目的条带小心的用刀切下来，用胶回收试剂盒回收以后，电泳检测回收情况（图2.2），。
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图2.2胶回收电泳条带
八、讨论
配制PCR反应体系时，PCR反应体系成分较多，所以各成分之间应选择最佳体系，所以每一种成分必须按一定量来添加，最后加入酶试剂，混匀。胶回收实验应按照说明书操作。本实验中条带较暗，可能是由于模板DNA浓度较小和洗脱不彻底造成的。
实验三 大肠杆菌感受态细胞制备、对照质粒转化
和感受性鉴定
本实验得分： 批改教师签字： 2014年 6月30、7月2日 一、实验目的
1.学习并掌握大肠杆菌培养、感受态制备、感受性的评价。 2.学会涂布的方法和技巧 3.了解相关的实验原理及方法 二、基本原理
本实验操作的是最基本和最经典的氯化钙法，细菌处于0℃、CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
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CaCl2处理的感受态细胞，一般每微克DNA能获得10至10个转化子，环化重组子分子愈小，转化率愈高，环状DNA分子比线性DNA分子的转化率高1000倍。本实验以事先抽提的CCC型完整质粒作为转化DNA，可根据长出的单斑数和所转化的质粒DNA的重量计算出所制备感受态的感受性。 三、实验材料
CCC型对照质粒，DH5α菌株。 四、主要仪器设备及耗材
净化工作台，恒温振荡器， S隔水式培养箱，低温离心机，微量移液器，恒温水浴锅等。 五、主要试剂
蛋白胨，酵母膏，氯化钠，氯化钙溶液（0.1mol/L），无菌甘油，双蒸水，单蒸水，琼脂，氨苄青霉素贮存液（100mg/ml）等。 六、实验步骤 （一）、大肠杆菌培养与感受态制备
1.配制含蛋白胨1%、酵母膏0.5%、氯化钠1%、pH7.0的LB液体和LB固体培养基各100ml；
2.培养基和培养皿灭菌，液体LB于4℃备用，固体LB待冷至60℃时倒板，平板倒置于4℃备用； 3.从－80℃贮存的大肠杆菌单克隆菌液中吸取10μl接种于三角瓶内的10ml LB液体培养基； 4.37℃、225rpm培养6h以上至OD600=0.5左右；
5.吸取100μl菌液接种于1个三角瓶中新鲜的10ml LB液体培养基上； 6.37℃、250rpm培养约2.5-4h至OD600=0.5左右；
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7.将菌液转入1个15ml无菌离心管中，冰水浴10min； 8.5000rpm、4℃离心6min；
9.弃上清，用4ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2轻轻重悬菌体至均匀； 10.冰水浴30min；
11.5000rpm、4℃离心6min；
12.弃上清，用0.5-1ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2轻轻重悬菌体至均匀；
13.用无菌1.5ml离心管分成每管100μl的小份，冰水浴保存2-7h后用于转化，4d内有效； 14.也可加无菌甘油至终浓度12.5%左右于-80℃长期保存备用。 （二）、大肠杆菌感受态转化对照质粒以评价感受性
1.将5μl （0.01μg）的质粒轻轻而均匀地加入1管DH5α感受态中，轻轻混匀； 2. 冰水浴30min； 3.42℃热激60sec； 4.迅速冰水浴2min；
5.沿壁轻轻加入900μl室温LB液体培养基；
6.37℃、180rpm复苏培养90min，同时在37℃倒置预热一个LB平板； 7.先在平板上涂布60μl 卡娜与80μl LB的混合物至完全吸入；
8.复苏结束后，吸取100μl菌液用灭菌冷却后的涂布棒均匀涂布于平板上； 9.37℃倒置培养18-24h至长出大小合适的菌落；
10.计数平板上的菌落数，并计算感受态的转化效率（转化克隆子/μg DNA）。 七、实验结果与分析
在LB平板上观察到约1160个成形的大肠杆菌单菌落（图3），由此计算大肠杆菌感受态的转化效率（转
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化克隆子/μg DNA）=1000×n=1000×1160=1.16×10，即每μg质粒DNA获得1.16×10个转化克隆子，说明效率正常，符合用于研究性实验的标准。但是培养皿中卫星菌落较多，可能的原因是抗生素质量问题或者涂板不均匀。
图3 感受态转化平板
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