的废液；
6.去蛋白：向吸附柱中加入500μl去蛋白液（RD），室温12000离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
7.漂洗：向吸附柱中加入700μl去蛋白液RW，室温静置2min，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
8．再次漂洗：重复步骤7；
9.空甩柱子：将吸附柱放回2ml收集管中室温12000rpm离心2min； 10.将吸附柱移入一个新的无RNase的1.5ml Eppendorf中。在吸附柱中央加入30μlRNase-Free ddH20，水浴3min，12000rpm离心1min，弃柱芯，保留洗脱液即为RNA；
11.取5μl RNA，加1μl 6×上样缓冲液混匀，以Trans2K Plus DNA Marker作为分子量标准，在1×TAE缓冲液中于120V进行琼脂糖凝胶电泳20min，于紫外成像仪中拍照，检查RNA的质量； 12.取 5μl RNA用DEPC处理过的水稀释，于快速核酸蛋白分析仪上测定OD230、OD260及OD280，根据OD260计算RNA的浓度，并以OD260/OD280的大小确定RNA的质量； 12.剩下的RNA保存于－80℃备用。 七、实验结果与分析
RNA提取电泳检测结果显示，图中所有组在不同大小都是弥散带，有的没有条带，说明RNA降解，实验失败（图6.1）。失败原因可能与磨样过程中的解冻有关，但是极可能是RNA提取后，置于冰水浴上等待一起电泳的过程中RNA降解。于此，RNA提取实验中除谨慎内外源RNase，还需谨慎低温操作和低温（至少-20℃）保存。 计算结果：原液RNA的浓度=0.113×0.04×10= 0.0452μg/μl;总RNA重量=0.0452μg/μl×30ul=1.356ug;抽提得率=0.001356%;OD260/OD280=1.07<2，说明RNA中存在较多蛋白质的污染；OD260/OD230 =0.82<1.8,说
明RNA中盐离子污染较严重。
图6.1 RNA提取电泳图
八、讨论 1. RNA很容易降解。在研磨材料时，要保证植物材料不能解冻，材料一旦解冻RNA就很有可能被降解，所以要不时的加液氮以保持研磨材料不被解冻。并且样品粉末加入Trizol中要马上混匀。马上震荡。
2. RNA的检测：经电泳检测和分光光度计法检测基本上可以评价RNA的质量。 3. 提取的整个过程必须使用无Rnase的Ep管和枪头，并且带上手套。
11
实验七 总RNA的反转录和目标基因cDNA片段的RT-PCR鉴定
本实验得分： 批改教师签字： 2014年 7 月 5 日 一、实验目的
用两步法RT-PCR扩增油菜CHS基因的全编码区cDNA，经琼脂糖电泳检测实验结果。 二、基本原理
RTase是依赖于RNA为模板的DNA聚合酶，根据olig引物能与mRNA的poly（A）杂交，指导全长cDNA第一链的合成；然后以cDNA为模板，根据CHS基因设计的BnCHS1正反向引物于适当温度下与cDNA模板退火，从而扩增目标基因BnCHS1的全编码区cDNA。三、实验材料 甘蓝型油菜幼叶总RNA 四、主要仪器设备及耗材
低温冰箱、微量移液器、PCR仪、双稳电泳仪及水平电泳槽、紫外凝胶成像系统等。 五、主要试剂
primeScript Rtreagert试剂盒 六、实验步骤 （一）、总cDNA第一链的反转录 1、去除基因组DNA反应
5×gDNA Eraser Buffer 1μl gDNA Eraser 0.5μl 总RNA Xμl
RNase-free dH2O Yμl（Y=5-1-0.5-X）
轻轻混匀，于PCR仪上42℃保温2min，DNA应当完全被消化，取出立即进入下一步的反转录。 2、反转录反应
RNase-free dH2O 0.5μl 5×Buffer 2.0μl RT Primer Mix 2.0μl Enzyme 0.5μl
轻柔混匀后立即放置PCR仪上进行反转录反应（程序：37℃，15min；85℃，30sec；4℃，5min），PCR产物于-20℃保存。
（二）BnCHS1全长cDNA的PCR扩增和检测
在一个0.2ml的薄壁PCR管中配置一个50μl的PCR反应体系：
ddH2O 39.5μl 10×PCR buffer（含有MgCl2） 5μl 10mmol/L-eachdNTPs 1μl 10μmol/LFBOG112 1μl 10μmol/LRBOG16 1μl 反转录产物（含有总cDNA第一链） 2μl 5U/μlEasy-TaqDNA聚合酶 0.5μl 总体积 50μl
七、实验结果
12
扩增全长cDNA没有成功，可能是反转录不成功导致的，也可能是PCR反应加样试剂失效。
图7 全长cDNA的PCR扩增电泳图
八、讨论
在进行RT-PCR时，实验环境中的RNase丰富，实验耗材和试剂应用RNase-free的，防止RNA的降解；同时操作时应戴手套和尽量少说话，防止RNase污染。此外，在cDNA第一链合成中，在RTase能承受温度下，尽量提高反转录温度有利于打开mRNA的二级结构，减少反转录流产。
实验八 目标基因编码蛋白的原核表达与鉴定
一、实验目的：
将已构建好的原核表达载体菌株进行培养并诱导整合蛋白的表达，通过SDS-PAGE电泳检测表达成功。 二、基本原理
原核表达一般程序：获得目的基因→准备表达载体→将目的基因插入表达载体中（测序验证）→转化表达宿主菌→诱导靶蛋白表达→表达蛋白分析→扩增、纯化、进一步检测。细菌体中含有大量蛋白质，具有不同电荷和分子量，强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质分离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上，不同蛋白质的迁移率仅决定于分子量。采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果，因而据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
三、实验材料
大肠杆菌BL21菌株，携带有重组原核表达载体pET28a(+)-BnCHS1 四、主要仪器设备及耗材
单加热型恒温振荡器，生化培养箱，低温离心机，电泳仪，电泳槽，微量移液器，离心管，枪头，涂布棒，培养皿，两面板 五、主要试剂
LB培养基，100mM IPTG，1.5M Tis-HCl，1M Tis-HCl，10%SDS，10×电泳缓冲液，10%过硫酸铵，2×SDS电泳上样缓冲液，考马斯亮蓝染色液，脱色液，低分子量蛋白质标准 六、实验步骤， （一）诱导表达
1.吸取深冷保存的含重组质粒的菌液10μl至10mlLB（含Amp100mg/L）中37℃、250rpm培养，复苏菌株并生长至对数中期，视深冷保存时间长短培养时间约需6-12h。
2.按1:50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加到含50mlLB培养基的250ml三角瓶中，37℃、250rpm震荡培养至OD600约0.6。
3.取部分液态作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度2mM作为实验组，两组继续28℃震荡培养6h。
13
4.分别取菌体1ml，离心12000g×30s收获沉淀，用100μl1%SDS重悬，混匀，70℃10min。 5.离心12000g×1min，取上清作为样品，可做SDS-PAGE等分析。 （二）SDS-PAGE电泳检测采用垂直式电泳槽装置
1.聚丙烯酰胺凝胶的配制 （1）分离胶的配制 （2）积层胶的配
2.样品处理：将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，离心12000rpm×1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。 3.上样：取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20μl低分子量蛋白标准品作对照。 4.电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压60V，分离胶电压100V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止。5.染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮蓝染色液染色，室温4-6小时
6.脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。
7.凝胶照相和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶照相，凝胶可保存于双蒸水或7%乙酸溶液中。若诱导样比对照多出一条约66kb的条带，即BnCHS1与6×His的融合蛋白，说明原核表达成功，可用蛋白纯化和活性鉴定等后续研究。
七．结果与分析
电泳染色出现问题，胶在染色摇床被摇破。而且胶的质量也出现了问题，在目标带区域出现一条未知的蓝色条线，将条带遮住因此不好判断出是否有目标蛋白。 八、讨论
蛋白电泳要配制积层胶和分离胶，积层胶的作用是将样品集聚成一条线，使各蛋白电泳时处在同一起跑线上，减少位置差异而引起的误差。分离胶可以将不同分子量大小的蛋白质分离开，分子量大的迁移的慢，分子量小的迁移的快。染色的时候要特别小心，转速不能太大，以免胶破。
实验九 植物表达载体转化根癌农杆菌及PCR检测
本实验得分： 批改教师签字： 2014年 6月30日7月2、3、4、5日 一、实验目的
掌握植物表达载体质粒转化根癌农杆菌的方法 二、基本原理
现用于植物基因工程二元载体系统的根癌农杆菌具有抗利福平和链霉素的能力，若植物表达载体具有
r
T-DNA外的抗生素（Kan）原核表达盒，则转化后的农杆菌能在同时含有利福平、链霉素和卡那霉素的平板上生长，其菌落经PCR鉴定的阳性克隆的菌液繁殖后作为工程菌株保存。 三、实验材料
根癌农杆菌菌株LBA4404的深冷保存单克隆菌液、CCC型pC2301M1B-BnCHS1质粒
14
四、主要仪器设备及耗材
超低温冰箱、离心机、培养箱、微量移液器、PCR仪、洁净工作台、双稳电泳仪及水平电泳槽、紫外凝胶成像系统等。 五、主要试剂
灭菌LB培养基、抗生素溶液、Easy-Taq DNA聚合酶、重组植物表达载体pC2301M1B-BnCHS1检测引物(F35S3N、RNOS5N)、1×TAE缓冲液、琼脂糖等。 六、实验步骤 （一）、根癌农杆菌培养与感受态制备
1.向灭菌三角瓶内加入10ml无菌LB液体培养基，并加入链霉素贮存液25μl 和利福平贮存液20μl； 2.从－80℃贮存的EHA105单克隆菌液中吸取10μl接种于上述配好的培养基中； 3.28℃、250rpm培养约2d至OD600=0.5左右； 4.如实验三中的方法一样制备和保存感受态。 （二）、植物表达载体转化根癌农杆菌
1.取1管－70℃保存的EHA105感受态于冰水浴解冻，或直接采用冰水浴保存的感受态； 2.刚解冻时轻轻加入5μl含有目的基因的植物表达载体质粒，轻轻混匀； 3.冰水浴5min；
4.浸没于液氮中冷激8min； 5.37℃水浴热激5min；
6.加900μl室温的LB/（Str25+Rif40）液体培养基后于28℃、200rpm振荡培养3-5h复苏； 7.复苏结束后于5000rpm室温离心5min；
8.吸900μl上清，余下的100μL用于重悬菌体，涂布于LB/(Kan100+Str25+Rif40)固体平板上； 9.28℃倒置培养2d左右直至长出直径约2mm左右的菌落备用； （三）、根癌农杆菌转化子的菌落PCR检测
于0.2ml的PCR管中配置25μl的反应体系，其包括：
ddH2O 20.65μl 10×PCR buffer 2.5μl 10mmol/L dNTPs 0.5μl 10 μmol/L F35S3N 0.5μl 10 μmol/L RNOS5N 0.5μl Easy-Taq DNA聚合酶 0.35μl
单菌落菌体 枪头蘸取少许 总体积 25μl
反应程序：94℃，5min；40×（94℃，1min；58℃，1min；72℃，1min）；72℃，10min；4℃，5min.
七、实验结果与分析
15