八、讨论
1. 大肠杆菌生长密度以刚进入对数期为好，可通过检测培养液的A600来控制，通常DH5a菌株的A600
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达到0.5时，细菌密度在5×10 个/ml，比较适合感受态细胞的制备，细菌密度过高或不足均会影响转化效率。
2. 制备大肠杆菌感受态是一定要控制低温，温度过高可能实验失败，在质粒转化大肠杆菌感受态细胞的过程中，热激温度和时间一定要准确，使条件达到最优。
实验四 PCR产物的TA克隆、蓝白斑筛选和阳性克隆子培养
本实验得分： 批改教师签字： 2014年 7 月 1、3 日
一、实验目的
掌握PCR产物的TA克隆技术及重组子鉴定与培养技术，为分子生物学与基因工程研究奠定基础。 二、基本原理
T-载体就是采用平末端酶如EcoRV在载体的多克隆位点中间切开，然后采用平末端转移酶将每条链的3′末端自动加上一个突出的dATP，因此最终的PCR产物具有一个短的粘性A末端。当采用T载体与PCR产物连接时，载体链末端的突出T与PCR产物链末端的突出A产生氢键配对，可以增加链接效率。采用T-载体与具有3′突出单碱基A的外源DNA片段进行的克隆方式，叫TA克隆。
重组子中由于外源DNA片段的插入使lacZ基因失活，不能形成α互补作用，在X-gal/IPTG的Amp平板上，含有阳性重组体的细菌为无色菌落或噬菌斑，反之空载体转化的细菌为蓝色菌落或噬菌斑。挑取白色菌落单克隆在含Amp的LB液体培养基中培养，菌液可用于目的基因的PCR鉴定、抽提质粒后的酶切图谱鉴定、测序鉴定等。 三、实验材料
PCR条带的回收产物（实验二保留），DH5α感受态细胞（实验三保留）。 四、主要仪器设备及耗材
净化工作台、恒温振荡器、隔水式培养箱、离心机、制冰机、微量移液器、恒温水浴锅、冰箱等。 五、主要试剂（盒）：
pGEM-T-Easy T载体试剂盒，灭菌LB液体培养基（实验三保留），LB平板（实验三保留），双蒸水，单蒸水，X-gal贮存液（20mg/ml），IPTG贮存液（200mg/ml），氨苄青霉素贮存液（100mg/ml）等。 六、实验步骤 （一）、PCR产物回收片断与T-载体的连接 在冰水浴上于200μl EP管中配置反应体系：
PCR产物回收片断 1.5μl Buffer 2.5μl PGM-T-Easy 0.5μl 连接酶 0.5μl
轻轻混匀，16℃连接过夜用于转化DH5α感受态。 （二）、重组T-载体转化大肠杆菌
以下操作中的无菌操作在超净工作台上进行：
先在平板上涂布80μl Amp、40μl X-gal和5μl IPTG至完全吸入；干后再涂入重悬菌液100ul。涂完后倒置于37℃培养箱过夜。
（三）、重组质粒转化子的培养 A) 吸取10ml LB液体培养基于一无菌三角瓶中，加入Amp贮存液10μl至终浓度为100μg/ml，混匀； B) 将含Amp的LB液体培养基平分于2支15ml灭菌试管中，每管5ml； C) 用灭菌黄枪头（200μl）各挑取1个白斑接种于试管的LB中；
D) 无菌封好管口，振荡摇床上于37℃、250rpm培养约9h至形成较浓的菌液备用。
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七、实验结果与分析
1.蓝白斑筛选结果与分析：
平板上有白斑10个、蓝斑10个，转化率为70/（70+10）*100%=87.5%<90%,重组率正常稍偏低。可能是凃板不均匀，涂布时三种液体没混匀后涂。
图4 蓝白斑筛选平板
八、讨论
1.在进行PCR产物回收片断与T-载体的连接时，一定要将T-载体与Solution I放于冰盒中，否则很容易失活，导致实验失败。
2.在进行大肠杆菌感受态转化实验时，动作一定要轻柔，因为感受态细胞的细胞壁很脆，动作太大可能会导致细胞壁破裂而细胞死亡。
3.涂板时，一定要将抗生素和重悬菌液等涂匀，尤其是平板中间部位。
4.PCR产物的TA克隆、蓝白斑筛选和阳性克隆子培养是分子生物学和基因工程实验的基本技术，熟练掌握该门实验技术具有基础性的作用，应认真、准确做好其中的每一步操作。
实验五 白斑克隆的菌液PCR检测、质粒提取与酶切鉴定
本实验得分： 批改教师签字： 2014年 7 月 4 日
一、实验目的
熟悉重组克隆子的基本鉴定技术，为以后的测序鉴定、载体构建等实验打下基础。 二、基本原理
本实验采用质粒提取（小量）试剂盒抽提质粒，其原理是碱裂解法结合离心柱纯化。白斑菌落培养在含Amp的液体培养基LB上过夜后质粒得到扩增，在EDTA存在条下溶菌酶破坏大肠杆菌细胞壁，NaOH和SDS崩解细胞膜，从而溶解大肠杆菌，RNase A降解RNA，蛋白质变性，细菌染色体DNA随着细胞碎片一起沉淀，而质粒DNA和少量可溶性蛋白、核糖核蛋白、少量染色体DNA等则进入上清液，上清液上柱后采用Wash buffer洗去蛋白质等杂质，然后用洗脱液洗下质粒DNA备用。
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质粒在琼脂糖电泳中的迁移率在一定范围内与其分子量呈正相关关系，但也与分子的拓普构象有关。相同构象时，迁移距离与分子量呈反相关。根据电泳中质粒条带数多少、迁移距离等情况可以判断质粒完整度。质粒纯度则以电泳和光密度测定联合分析。
白斑质粒如果的确是重组质粒，采用它作为模板进行目的基因的PCR鉴定，就会扩增出目的基因的特异片段，而空质粒则应当为PCR阴性。 三、实验材料
白斑单克隆培养的菌液（实验四保留），PGM-T-Easy载体测序引物组合等。 四、主要仪器设备及耗材
PCR仪、净化工作台、常温离心机、制冰机、微量移液器、电热恒温水浴锅、紫外成像仪、双稳定时电泳仪及水平电泳槽、冰箱等。 五、主要试剂（盒）
质粒提取（小量）试剂盒（EasyPure Plasmid MiniRrep Kit），Easy-Taq DNA聚合酶、PCR buffer(含氯化镁)，dNTP（10mmol/L），双蒸水，单蒸水，矿物油，琼脂糖，6×上样缓冲液，Trans2K Plus DNA marker，GoldView核酸染料，1×TAE缓冲液，限制酶BamHI、HindIII及Buffer（NBI Fermentas产品）。 六、实验步骤
（一）白斑质粒的抽提
1.在超净工作台上从对数晚期的培养菌液中取2—3ml于1.5ml离心管中；13400rpm室温离心2分钟； 2.P2使用前，水浴，彻底溶解，恰当的摇匀，37℃预热；
3.吸干上清，加入250μl P1重悬菌体摇匀，呈现乳状溶液，室温放置5min； 4.加入250μl P2溶液，立即温和颠倒5-10次（2—3秒内），乳状液变透明，10秒内加P3；
5.加入350μl P3溶液，立即温和颠倒5-10次混匀，出现大量白色羽毛状沉淀，继续摇1—2分钟； （二）菌液目的基因的PCR检测
在一个0.2的PCR管中配置一个25μl的PCR反应体系，其中包括：
ddH2O 14.40μl 10×PCR buffer 2.5μl 10mmol/L dNTPs 0.5μl 10μmol/L FCHSA 0.5μl 10μmol/L RCHS 0.5μl 菌液 2.0μl Taq DNA 聚合酶（5U/μl） 0. 5μl 总体积 25μl 94℃ 6min；40个循环：94℃ 1min；60℃ 1min；72℃ 1min30sec；72℃ 10min；4℃ 5min （三）白斑质粒上目的基因的酶切检测
在一个200μl的无菌EP管中配置酶切反应体系：
重组质粒 5μl NE Buffer 2 2.5μl EcoRI 0.5μl ddH2O 17μl 总体积 25μl
轻轻混匀后，于37℃水浴4h，（酶切2小时的时候混匀一下，）取5μl电泳检测与未切的质粒作对比，以Trans2K Plus DNA marker作为分子量标准，如果酶切彻底，酶切产物电泳时只会看见1条约1.3kb的目的基因条带和1条2.7kb的线状载体条带。如果酶切不彻底，则延长水浴时间，直至电泳检测确认酶切彻底。
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七、实验结果与分析
菌液PCR电泳显示，（图5.1）。
图5.1 菌液PCR电泳
抽提质粒电泳没有条带显示，抽提质粒失败，可能的原因是质粒提取试剂盒有问题，或者加S2裂解液时颠倒混匀不当，没能完全变成清澈透明状。
图5.2 质粒抽提电泳
酶切电泳显示，第2组泳道有两条带，一条在1000bp附近，属于目的基因条带，另一条约3.5kb，为酶切之后的开环载体片段，两条带清晰（图5.3），证明酶切完全。
图5.3 酶切电泳
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八、讨论
1.在提取质粒时，出现絮状的蛋白质沉淀后，这个时候不能够用力的颠倒，而要轻柔的混匀。通过离心后用枪头将上清液轻轻的吸到另一个新的离心管中，这个操作一定要注意宁可损失一部分上清液也不能贪多而将管底的蛋白沉淀吸到上清液中去。如果不小心吸到了，则要通过再次离心将其去除,而且动作一定要轻柔，避免上清液过于震荡。
2．如果质粒中重组有目的片段，那么质粒就可以作为PCR反应的模板，通过扩增以后，在电泳条带中大致可以判断出质粒中重组的片段是否是实验的目的片段。这也是一个用来检测重组质粒很有效的方法。
3．对所提取的质粒进行酶切的目的也是为了进一步验证载体上是否重组有实验的目标片段。将目标片段连接到载体上以后，目标片段会随着质粒增殖而得到增殖。这时用提取出来的质粒进行酶切，就可以将目标片段切下来，然后在经电泳检测，从电泳条带的分子量的大小进一步确认载体上确实重组有目标片段。
实验六 植物总RNA的提取与鉴定
本实验得分： 批改教师签字： 2014年 7 月 3 日 一、实验目的
分离纯化植物RNA也是植物分子生物学和基因工程的基本技术，在通过反转录合成cDNA的基因克隆技术、研究基因表达的Northern blotting分析或RT-PCR分析、研究转录起始点的引物延伸分析等多方面具有重要的用途。本实验学习利用离心柱法试剂盒提取植物叶片总RNA及其检测的基本技术。 二、基本原理
液氮下磨细的组织样品加入到试剂盒的提取液中，在用力混匀下，蛋白质等杂质迅速变性，通过离心使变性的蛋白质、多数基因组DNA、细胞壁残渣以及其它沉淀状的杂质一道去除，上清液上离心柱后RNA被柱心的基质所吸附，但柱上也会吸附一些基因组DNA、蛋白质、盐、有机物等杂质。通过去蛋白液、漂洗液的上柱处理可以去除蛋白质、盐、有机物等杂质，彻底甩干柱子后用纯水溶解柱芯上的RNA，然后通过离心将RNA收集到管底。 三、实验材料
新鲜的甘蓝型油菜(Brassica napus L.)叶片。 四、主要仪器设备及耗材
RNA专用通风厨，旋涡混合仪，手掌离心机，低温离心机，Sanyo SIM-F140制冰机，TOMY SX-500自动灭菌锅，优普超纯水制造系统，Eppendorf research微量移液器系列，紫外成像仪，DYY-12C型双稳定时电泳仪及水平电泳槽，BIO-RAD SmartSpec Plus快速核酸蛋白自动分析仪，海尔冷冻冷藏双用冰箱，YDS-30和YDS-10液氮生物容器及液氮，美的微波炉；高温或DEPC处理过、RNA专用的研钵、离心管（1.5ml）、枪头（10、200和1000μl）、双面板、枪头盒、离心管盒（1.5ml）等。 五、主要试剂
总RNA提取试剂盒，液氮，DEPC，无水乙醇，氯仿，DEPC处理过的双蒸水，单蒸水，琼脂糖，Trans2K Plus DNA Marker，6×上样缓冲液，GoldView核酸染料，1×TAE缓冲液。 六、实验步骤
1.预加裂解液：向1个1.5ml离心管中加入1ml 裂解液RZ，待用；
2.磨样：称取0.15g左右甘蓝型油菜幼叶，在研钵中用液氮磨细，将冷冻状态下的植物粉末用小勺迅速转入加有裂解液的离心管中，迅速用旋涡混合仪混匀2min；
3.氯仿处理：室温静置5min，然后加入200μl氯仿，剧烈震荡15sec，室温静置3min，12000rpm离心5min；
4.沉淀：吸上清转移至1个新的1.5ml离心管中，加入0.5倍体积无水乙醇，混匀；
5.上柱：将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱（CR3）中，室温12000rpm离心30sec，弃掉收集管中
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