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人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册技术审查指导原则
本指导原则旨在指导注册申请人对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。
本指导原则是对人表皮生长因子受体2基因扩增检测试剂盒（荧光原位杂交法）的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。
本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
一、范围
人表皮生长因子受体2（Human Epidermal growth factor Receptor 2，HER2）基因定位于染色体17q12，是表皮生长因子
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受体（EGFR）的成员之一，HER2基因编码分子量为185kDa的酪氨酸激酶活性跨膜糖蛋白。HER2蛋白主要通过与家族中其他成员形成异二聚体而与各自的配体结合；当异二聚体与配体结合后，激活酪氨酸激酶的活性。参与细胞的增殖、凋亡调控、血管和淋巴管新生等生物学功能。HER2蛋白的过表达主要是由于HER2基因的扩增，可导致肿瘤细胞内信号通路的异常活化，与肿瘤的发生发展和侵袭转移有关。HER2基因的扩增和蛋白的过表达均可称为HER2阳性，该情况出现于部分原发性浸润性乳腺癌、胃及胃和食管交界处癌（以下统称胃癌）等患者中。
对于浸润性乳腺癌适应症，HER2阳性是指免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）检测结果为（3+），或原位杂交方法（In situ Hybridization，ISH）检测结果为基因扩增。而IHC检测结果为（2+）的病例为不确定，需进一步应用原位杂交方法进行HER2扩增状态的检测。对于胃癌适应症，HER2阳性是指IHC检测结果为HER2（2+）的同时ISH检测结果为基因扩增，或IHC检测结果为HER2（3+）。
对HER2阳性的乳腺癌和胃癌患者进行联合抗HER2靶向治疗（如抗HER2单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂等）使得部分患者的生存状况得到改善，但是在HER2阴性的患者中没有效果。准确地检测HER2蛋白表达和基因扩增状态是抗HER2单克隆抗体分子靶向治疗患者筛选和疗效预测的前提，对乳腺癌和胃癌的临床治疗和/或预后判断至关重要。对于浸润性乳腺癌适应症，HER2是患者重要的预后指标，也是抗HER2药物治疗的主要预测指标。对于胃癌适应症，HER2是晚期胃癌的疗效预测标志物。
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本指导原则适用于采用荧光原位杂交方法检测手术切除样本和活检样本的组织切片中的HER2基因扩增情况，包括HER2基因平均拷贝数（单信号）、HER2基因平均拷贝数和该基因所在的第17号染色体着丝粒（CEP17）序列平均拷贝数的比值（双信号）。对于其他应用亮视野原位杂交法检测HER2基因扩增水平的方法，如显色原位杂交法（Chromogenic In Situ Hybridization，CISH）和银增强原位杂交法（Silver—enhanced In Situ Hybridization，SISH），可能部分要求不完全适用或本文所述技术指标不够全面，申请人可以根据产品特性对不适用部分进行修订或补充其他的评价和验证资料，但需阐述不适用的理由，并验证替代方法的科学合理性。
本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。其他未尽事宜（包括产品风险分析资料等），应当符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称《办法》）等相关法规要求。
二、注册申报资料要求 （一）综述资料
综述资料的撰写应符合《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）（以下简称2014年第44号公告）的相关要求。内容主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、有关产品主要研究结果的总结和评价以及同类产品在国内外批准上市的情况介绍等内容。重点内容要求如下：
1.预期用途：HER2基因及其家族简介，在相关适应症中的表达情况，与组织病理学特征的关系，其扩增情况与乳腺癌和胃
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癌治疗方案制定以及预后判断的关系等。
2.产品描述：荧光原位杂交法（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）的技术原理，目标基因的座位区域，探针的设计原则以及标记的荧光染料，细胞核复染方式，以及结果判读标准和统计方式等。
3.同类产品上市情况：与相同或相似方法学（如IHC、其他原位杂交方法等）的产品在性能、上市情况和结果判读等方面的比较。
（二）主要原材料研究资料
申请人应验证主要原材料的性能指标符合产品研发、生产和检验要求，以确定设计要求或者外购厂家，并制定主要原材料的质量标准。
1.探针：根据不同用途，分为基因特异性探针（HER2）和着丝粒探针（CEP17）两种类型。探针可选择细菌人工染色体（BAC）克隆或者聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）等方法进行制备。下述内容是对于探针制备通用要求的举例，如有其他替代方法，应详细阐述其科学合理性。
1.1基因特异性探针
1.1.1探针序列的确定：包括探针所在基因的位置区域，人类基因组文库的筛选、比对和特征确认过程。
1.1.2人类基因组文库克隆的鉴定：一般检测与基因区域相关的序列标记位点（STS）的存在情况，包括引物的设计，PCR过程和产物的电泳图谱。
1.1.3探针的标记：一般为酶促反应或者化学合成方法，应详述标记方式的选择、反应体系和过程、产物的纯化方式等。
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1.2着丝粒探针：包括微卫星重复单元的序列，PCR引物的设计和选择，荧光染料标记的反应体系、过程和产物的纯化方式等。
1.3探针的质量控制：性能指标一般包括浓度、纯度、Tm值（如适用）、杂交效率、特异性等，可使用测定260nm处紫外吸收峰值、测定260nm与280nm处紫外吸收峰值的比值、琼脂糖凝胶电泳、染色体分散良好的中期相分裂细胞杂交验证等方式。
2.荧光染料：技术指标包括最大发射/吸收峰，与目的核酸片段的结合能力，持续被激发光源照射时的抗淬灭能力等。
3.杂交缓冲液：应描述组成配方，说明各成分的作用。质量标准应包括pH值、盐离子浓度、甲酰胺浓度、硫酸葡聚糖浓度等。
4.人Cot-1 DNA（如适用）：是由大量人类基因组重复序列组成的高浓度DNA，能封闭样品中的DNA重复序列，降低检测背景。要求能有效封闭背景信号，避免由于非特异性杂交而影响检测结果的判读。应评价人Cot-1 DNA对样本检测背景信号的封闭效果，方法可选择通过观察背景强度以及非特异杂交的强度而确定人 Cot-1 DNA的用量。如有其他清除背景信号的方法，应充分说明其科学合理性。
5.二脒基苯基吲哚（DAPI）复染剂：评价指标包括对细胞核的染色能力以及抗淬灭能力等。
6.企业参考品：应包含阴性参考品、阳性参考品和特异性参考品，并详细说明参考品的来源、组成、制备和保存情况。阳性参考品可选择经已上市产品确认HER2基因扩增的乳腺浸润癌/胃癌
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