组织，或者人乳腺癌/胃癌细胞株。阴性参考品可选择经已上市产品确认HER2基因无扩增的肿瘤组织，或者肿瘤细胞株。特异性参考品可选择健康人外周血培养细胞，应含有较多染色体分散良好的中期分裂相淋巴细胞。
7.质控片（如有）：可作为试剂盒的组分或者单独配置，包含阴性质控片、临界值质控片和/或阳性质控片。可选择临床组织样本或者HER2扩增状态确定的细胞株。
（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料
申请人应描述主要生产工艺及确定依据，详述工序流程以及各个步骤的质量关键控制点。
申请人应建立适当的反应体系，以平衡最佳检测信号和背景强度的关系。反应过程包括样本预处理和杂交检测两个步骤，其中样本预处理过程一般包括样本脱蜡、样本预处理、蛋白酶处理三个环节，杂交检测过程一般包括变性、杂交、杂交后洗涤、DAPI复染四个环节。另外，应合理控制样本的质量并明确要求。
1.样本的采集、固定、制片、保存和运输：应对采样部位及方法、样本中肿瘤组织的含量、离体到固定的温度及时间、固定温度及时间、保存和运输的条件和时间进行研究或者验证，结合组织形态及病理学特征，保证样本的准确性以及其中DNA的完整性。另外，切片质量对检测结果的判读十分重要，应对切片厚度进行研究或者验证，要求计数区域的细胞胞核边界完整、DAPI染色均一、细胞核无重叠、荧光信号清晰。不同类型的样本应分别验证。具体可参考国际或国内相关标准操作规程；如与标准操作规程有差异，应进行充分研究。
2.样本预处理：应对脱蜡条件、预处理温度及时间、特定盐
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溶液的离子强度、蛋白酶的消化条件进行充分研究，以避免处理过程中组织和DNA的损失造成检测结果出现假阴性。如其中预处理过程可选择多个温度/时间的组合，蛋白酶消化过程可选择多个持续时间进行研究。温度/时间的组合是指首先在同一时期的几个不同温度下进行，然后在优化温度条件下的几个不同持续时间进行。
3.样本变性条件：应对样本变性处理的温度、持续时间的组合进行充分研究，以保证样本中DNA双链的充分解链，有利于后续探针和样本的结合，提高杂交效率以及保证杂交的特异性。如选择多个温度/时间的组合进行研究。
4.样本杂交条件：应对样本杂交步骤的温度、持续时间的组合进行充分研究，以达到探针和样本的最佳结合效率。如选择多个温度/时间的组合进行研究。
5.杂交后洗涤条件：应对缓冲液的盐浓度和去垢剂成分，以及清洗温度、时间、次数的组合进行充分研究，以达到最佳的杂交严格度。要求尽可能去除样本中的核蛋白等干扰物质，避免非特异性杂交，降低背景干扰，并且增加目标信号的强度。如选择多个缓冲液浓度以及多个清洗条件的组合进行研究。
（四）分析性能评估资料
申请人应使用多批产品进行研究，建立稳定可靠的性能指标。需提交在产品研制和成品验证阶段对试剂盒进行的所有性能评价的研究资料，包括方案设计、研究方法、材料和设备、验收标准、试验数据（包括代表性彩色图片）和结果统计分析等详细资料。建议着重对以下性能指标进行研究：
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1.灵敏度
主要反映产品检测时探针与目标基因位点的结合效率，也称为杂交效率。由于组织固定时蛋白质和核酸产生的分子间交联等对靶核酸具有屏蔽作用，探针穿透细胞的能力不同，导致产品对于不同类型样本的杂交效率存在性能差异；应使用临床应用环境中所有可能的样本类型中具有代表性的类型进行评估。方法可选择20个乳腺浸润癌/胃癌病例的组织样本，以及20个癌旁正常组织或者良性疾病组织样本；对同样数量的细胞随机进行分析计数。每例组织样本应至少检测20个细胞，分析统计HER2基因荧光信号数量，或者同时显示HER2基因位点标记和第17号染色体着丝粒（CEP17）位点标记的荧光信号的细胞占全部细胞的比例。
2.特异性
主要反映HER2和CEP17探针对目标序列识别的特异性。建议使用中期分裂相的外周血淋巴细胞进行涂片分析。选择5份以上正常人的外周血培养细胞涂片样本，每例样本应至少检测20个染色体分散良好的中期分裂相细胞，对至少200个靶位点进行分析计数；结合染色体G显带分析，统计细胞核染色体上正确位点的杂交信号占全部杂交信号的比例。应使用标准的细胞遗传学技术识别信号位点，例如染色体形态学分析、染色体区段染色、反向DAPI条带等技术；考察在HER2基因位点（17q11.2-q12）和/或第17号染色体着丝粒位点（17q11.2-q11.1）的特定荧光信号占全部荧光信号的比例。
3.阴、阳性符合率
主要反映产品对不同类型样本中HER2基因的检出能力和
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准确性。应使用临床应用环境中所有可能的样本类型中具有代表性的组织类型进行评价，并提供样本来源、唯一可溯源编号、病理组织类型，以及明确的HER2基因扩增状态。对于适应症为乳腺癌的情况，用于评价的样本类型应包括乳腺浸润性癌非特殊类型、乳腺浸润性小叶癌、小管癌、粘液癌，良性疾病（如腺病及纤维腺瘤）以及正常乳腺组织等。对于适应症为胃癌的情况，用于评价的样本类型应包括肠型、弥漫型、混合型（Lauren分型）胃癌，良性疾病（如胃粘膜慢性炎症）以及正常胃组织等。每种组织类型设置2至3例样本进行评价。建议着重评价申报产品对IHC检测结果为HER2（2+）样本的HER2基因扩增状态的检测能力。
4.精密度
申请人应充分考虑到配套检测系统以及使用环境的因素：包括荧光显微镜的特征、激发光源及过滤器的性能参数、物镜放大倍数等，以及不同时间、地点、操作人员、检测次数对结果判读的影响；对可能导致检测之间差异的主要变量进行验证。用于精密度评价的参考品应选择HER2扩增、HER2无扩增以及临界值的连续切片组织样本。其中临界值样本和成簇扩增的样本应分别设置验收标准（标准差以及变异系数的范围）。建议参考下述方法进行各个指标的评价：
4.1批内精密度：由同一操作人员使用同一批次产品进行检测，每例样本重复检测多次，对结果判读的一致性进行统计分析。
4.2批间精密度：由同一操作人员使用多个批次产品进行检测，每例样本重复检测多次，对结果判读的一致性进行分析统计。
4.3日间精密度：在多个不同日期，由同一操作人员使用同
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一批次产品进行检测，对结果判读的一致性进行统计分析。
4.4人员间精密度：由数位操作人员使用同一批次产品进行检测，每份样本由数位阅片人员进行独立结果判读。对不同操作人员/阅片人员对同一例组织样本检验方法以及结果判读的一致性进行分析统计。
4.5室间精密度：建议申请人选择不同的实验室进行检测间一致性的评价。
（五）阳性判断值确定资料
HER2检测结果的判读标准不断进行着更新，申请人应参考最新版临床指南性文件建立阳性判断值。应提交申报产品判读规则以及预设阳性判断值所依据的文献资料，并采用具有统计学意义数量的样本对判读规则以及预设阳性判断值进行验证。应包含HER2扩增、HER2无扩增以及一定数量的临界值（阳性判断值附近）组织样本，包括HER2/CEP17荧光信号总数比值在2附近（1.8～2.2），或者每个细胞的平均HER2拷贝数在4～6附近的样本。
首先设定检测结果重复性较好的目标，即HER2平均拷贝数或者HER2平均拷贝数/CEP17平均拷贝数的标准差/变异系数范围验收标准，确定初始统计细胞区域和数量，并在结果不确定时纳入更多区域或数量进行统计。
然后建议参照组织病理学特征或者IHC结果确定可能存在扩增的浸润性乳腺癌/胃癌区域，选择细胞核大小一致、胞核边界完整、DAPI染色均一、细胞核无重叠、荧光信号清晰的细胞，随机计数2个区域中的至少20个细胞，并对结果进行统计分析。
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