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摘要
CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞。微载体细胞培养开始于19世纪60年代末期，最早使用离子交换凝胶（DEAE-Sephadex A50）作为载体，轻微搅动即可悬浮在培养基中。由于这种微载体带有电荷，利于细胞贴附于载体上进行生长繁殖。载体处于悬浮状态时，这样既可大大增加细胞附着面积，又使细胞能与培养基充分接触，进而有利于细胞的生长，因此能达到大量培养细胞的目的。后来根据细胞附着生长的特点，对微载体进行改良，使其电荷或其介质更利于细胞附着和生长。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面，1 g 微载体其比表面积可达6000 cm2，从而可实现细胞的高密度培养。首先将CHO细胞在无血清培养基（SAF-CHO-G-004）中进行无血清驯化。其次将CHO细胞（成功用无血清驯化后的细胞）用0.25%胰酶消化制成细胞悬液后，沿导流管加入含明胶微载体和SAF-CHO-G-004细胞培养基的WhcltonBioster瓶罐中连续培养生成一定量的种子细胞。最后将种子细胞进行大规模培养。运用半连续式培养来操作：在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。最后在细胞培养过程中进行细胞常数的检查和培养基内污染物的检测一些抗凋亡策略来增加细胞培养的效率。
[关键字]CHO细胞;明胶微载体;无血清培养;半连续式培养
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目录
摘要 ....................................................... 1 关键字：CHO细胞 明胶微载体 无血清培养 半连续式培养 .......... 1 绪论 ....................................................... 3 1.2CHO细胞培养的特性 ....................................... 3 2.2.1培养基的物理性质 ...................................... 5 2.2.2无血清培养 ............................................ 7 3.1.2蛋白质作基质的微载体 .................................. 8 3.1.3微载体培养原理与操作 .................................. 9 3.2.2微载体培养种子细胞 ................................... 12 3.2.3微载体培养的细胞传代 ................................. 12 3.3半连续式培养（semi-continuous culture） 操作 ........... 12 4.2细胞常数检查 ........................................... 14 4.3CHO细胞培养内污染物的检测 .............................. 14 4.3.2真菌污染对细胞的影响及污染物的检测 ................... 15 4.3.3支原体污染对细胞影响及污染物的检测 ................... 16 5抗凋亡策略在细胞大规模培养中的应用 ....................... 16 5.1 营养物质抗凋亡 ........................................ 17 5.2 基因抗凋亡 ............................................ 17 5.3 化学方法抗凋亡 ........................................ 17 参考文献： ................................................ 18
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绪论
1.1引言
CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美国科罗拉多大学Dr. Theodore T. Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n＝22，系亚二倍体细胞。ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸-_-半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。
1.2CHO细胞培养的特性
CHO细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：
动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；培养过程需氧量少(氧传质系数kLa 大于10 h-1即可满足每毫升107 个细胞的生长)；培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；原代培养细胞一般繁殖50 代即退化死亡；代谢产物具有生物活性，
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生产成.本高，但附加值也高。 2.1DMEM培养基的组成与制备 2.1.1DMEM培养基的组成
序号 化合物名称 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
无水氯化钙 硝酸铁 .9H 氯化钾 无水硫酸镁 氯化钠
无水磷酸二氢钠 L-盐酸精氨酸 L-盐酸胱氨酸 L-谷氨酰胺 甘氨酸 L-盐酸组氨酸 L-异亮氨酸 L-亮氨酸 L-盐酸赖氨酸 L-甲硫氨酸 L-苯丙氨酸
含量 (mg/L) 200.00 2 O 0.10 400.00 97.67 6400.00 125.00 84.00 63.00 584.00 30.00 42.00 105.00 105.00 146.00 30.00 66.00
序号 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
化合物名称 L-丝氨酸 L-苏氨酸 L-色氨酸 L-酪氨酸钠盐 L-缬氨酸 D-泛酸钙 氯化胆碱 叶酸 肌醇 烟酰胺 核黄素 盐酸硫胺 盐酸吡哆辛 葡萄糖 丙酮酸钠 酚红
含 量 (mg/L) 42.00 95.00 16.00 104.00 94.00 4.00 4.00 4.00 7.20 4.00 0.40 4.00 4.00 1000.00 110.00 15.00
将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下，并入容器。加注射用水（水温20℃～30℃）到950毫升，轻微搅拌溶解。
（1）加入2.438克碳酸氢钠。
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（2）轻微搅拌溶解，加注射用水至1升。
（3）用1mol / L 氢氧化钠溶液或 1mol / L盐酸溶液调pH至所需值。
（4）用0.2μm滤膜正压过滤除菌。 （5）溶液应在2℃－8℃下避光保存。 2.2.1培养基的物理性质
无菌：无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养液不仅对细胞是高营养物，对细菌和霉菌也是高度营养物，细胞培养中如污染微生物，其繁殖比细胞快且能产生毒素使细胞死亡，因此细胞培养技术的关键之一是防止污染。污染微生物可来源于组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身。因此，培养室的空气等要彻底消毒，所有操作均要严格实行无菌操作，各种物品拿入操作台前应消毒，用洒精擦表面，用前于紫外线照；操作者洗手、泡手，酒精擦手，打开培养管前须在火焰上烙烧一下瓶口以使灰尘固定，操作时须将瓶、管斜放，吸管注入液体应避免和瓶口接触，操作时禁止讲话。
温度：组织培养的最适温度为35-37℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。培养细胞对低温的耐受力比高温强。温度增加2-3℃对细胞产生不良影响，使之在24小时死亡，温度在43℃以上，细胞大多被杀灭，而低温对细胞影响较小，细胞臵于25-35℃时，细胞仍能生存和生长，但速度缓慢，放在4℃数小时之后，再臵37℃培养，细胞仍能继续生长。
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