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培养，建立起适应无血清无动物组分培养的CHO种子细胞库。
连续适应
分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到SAF-CHO-G-004细胞培养基中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。
（1）以2倍正常接种密度接种生长活跃的物到75%有血清培养基：25％SAF-CHO-G-004细胞培养基中，传代培养。
（2）当细胞密度>5×105细胞/ml时，以2×105到3×105细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SAF-CHO-G-004细胞培养基为50∶50的混合培养基中传代培养。
（3）以2×106到3×106细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75% SAF-CHO-G-004细胞培养基中传代培养。
（4）当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml（接种后4到6天），在100％SAF-CHO-G-004细胞培养基中传代培养。
（5）每隔3到5天，当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的物应该再次传代培养。
建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SAF-CHO-G-004细胞培养基/有血清混合培养基中进行几次传代。在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SAF-CHO-G-004细胞培养基包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。
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3.2.2微载体培养种子细胞
将上述CHO细胞（成功用无血清驯化后的细胞）用0.25%胰酶消化制成细胞悬液后，用培养基调整接种细胞浓度为3×105/mL。沿导流管加入含明胶微载体和SAF-CHO-G-004细胞培养基的WhcltonBioster瓶罐中37℃，50 r/min 搅拌30分钟静臵30分钟（37℃）。37℃，50 r/min 搅拌2分钟再静臵2～4小时（37℃）（以利细胞贴附） 、37℃，50 r/min 持续搅拌培养每天换液1/2～3/4量，并取样2～3mL，行染色计数连续培养三天细胞在明胶微载体上生长良好，经计数可达1×106/ml细胞浓度，扩增了三倍。基本达饱和密度，此时可以消化传代，进行扩大培养。 3.2.3微载体培养的细胞传代
连续培养3天左右，细胞已基本在载体上铺满，已达饱和，此时为了扩大生产细胞，采用胰酶柠檬酸盐消化，并进行高速搅拌，可成功地将CHO细胞从载体上解离，取样检查，计算解离率。即消化前先取样染色计数的细胞数为分母，消化后取细胞悬液，计数的细胞数为分子，两者进行比较即得解离率。结果解离率可达69%，当细胞扩增至3～4倍时，消化解离效果好。解离的细胞又可扩大再吸附，再进行微载体悬浮培养，细胞密度又可达1×106/mL。
3.3半连续式培养（semi-continuous culture） 操作
半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，
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使反应器内的总体积不变。
这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。
用明胶微载体系统进行细胞培养的放大：
可通过增加微载体的含量或培养体积进行在DMEM-无血清培养基中用半连续式培养（semi-continuous culture） 操作进行放大。 4细胞培养过程中检测 4.1细胞生长的检测
细胞计数 消化后的细胞要加入培养液中，制成一定浓度的细胞悬液，在分装入培养容器之前，需计算出细胞悬液的浓度，即细胞数/ｍL悬液。另外也应测定细胞生活状态，区别出活细胞和死细胞数，只有活细胞才有效数值，计算出细胞浓度后，根据拟分装的瓶数和所需浓度，再将细胞悬液稀释进行培养。
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活体染色 台盼蓝活体染色简单易行，是常用检查细胞存活的方法，用台盼蓝染液，染后可见死细胞染成均匀的蓝色，活体细胞不着色。
细胞计数 用血球计数板做细胞计数。根据情况用营养液稀释与否均可。做法是用吸管吸取少许染色的细胞悬液滴于计数板上，使悬液自由充满盖片下方间隙，勿留气泡。稍后片刻，镜下观察并计算出四角大格内的细胞数，压线只计上线和右线的细胞，然后按下式计算出细胞浓度：细胞数/ｍL原液=四角大格内的细胞总数/4*10000*稀释倍数 4.2细胞常数检查
细胞生长 初代组织培养或细胞悬液接种以后，都有一个长短不同的潜伏期。一般在第二天就可见细胞生长，一周就可接连成片。
细胞生长的四个阶段
游离期：刚接种后，细胞在培养液中呈悬浮状态，此时细胞胞质回收，胞体变圆形。
吸附期：为细胞贴附于培养壁过程。 繁殖期：生长期。
退化期：当细胞长满瓶壁以后，如不及时做传代，由于营养物消耗和代谢物积累，细胞进入退化期。
细胞形态 生长良好的细胞，在一般显微镜下观察时透明度大，轮廓不清，只有用相差显微镜，才能看见细胞的细微形态。
营养液：在正常情况下，培养液呈桃红色 4.3CHO细胞培养内污染物的检测
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4.3.1细菌污染对培养细胞的影响及污染物的检测
常见的污染细菌有大肠杆菌、假单孢菌、葡萄球菌等。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，污染情况用倒臵显微镜观察不易判断。怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养。
如果培养无真的细菌污染，24小时内可以获得阳性结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20分钟一代，会使培养系统中很快产生大量细菌，后者不仅可以消耗培养系统中的养分，还能释放大量代谢产物。几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。细菌污染大多数可以改变培养液pH，使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。 4.3.2真菌污染对细胞的影响及污染物的检测
微生物污染中以真菌最多，真菌种类繁多，形态各异，但是污染后易于发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。念珠菌和酵母菌卵圆形，散在细胞周边和细胞之间生长。真菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞。抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。
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