②不正常幼苗：
根系 初生根有缺陷，如生长受阻或残缺、发育不良、破损、从根尖有裂口、萎缩、很纤细、缩陷在种皮内、负向生长、水肿状、由初生感染引起的糜烂。如果初生根有缺陷，即使产生了次生根，仍为不正常幼苗。
茎轴系统 下胚轴有缺陷，如缩短变粗或缺失、深度破损或有裂缝、裂口穿透胚轴、过度弯曲或形成环状、紧度扭曲或形成螺旋状、极度纤细、水肿状、由初生感染引起的糜烂。
子叶 有缺陷，已有50%以上的组织没有正常功能，如肿胀性卷曲或畸形、分离或缺失、变色或坏死、水肿状、由初生感染引起的糜烂、顶芽或周围组织有缺陷。
（7）甘蓝种子发芽方法 甘蓝种子发芽技术规定（TP,20～30℃,20℃，5d，10d，新收获的休眠种子须在5℃预先冷冻3～5d，或用0.2%的KNO3湿润发芽床）。
采用9cm玻璃培养皿纸床，每皿垫入两层浸湿的发芽纸，数种置床，每皿100粒种子，四次重复，放入20～30℃变温或20℃培养，第五天计数正常发芽种子数，第十天计数正常发芽种子数、不正常发芽种子数和死种子数。
①正常幼苗（全部主要构造均应正常）：
根系 初生根完整或仅有轻微缺陷，如褪色、有坏死斑点、破裂不深且已愈合。 幼芽 下胚轴完整或仅有轻微缺陷，如褪色、有坏死斑点、破裂斑点且已愈合、稍有弯曲。
子叶 完整或仅有轻微缺陷，无功能组织少于50%，有三片子叶。 顶芽 完整。
②不正常幼苗（有一个或几个主要构造不正常，正常发育受阻，或整个幼苗有缺陷，如畸形、破碎、先长子叶后长根、两株连生在一起、黄化或白化、纤细、玻璃状、由初生感染引起的糜烂）：
根系 初生根有缺陷，如发育迟缓、短小、破损、从顶端撕裂、收缩、纤细、卷缩在种皮里、负向生长、玻璃状、由初生感染引起的糜烂、即使有次生根存在，也应划分为不正常幼苗。
幼芽 下胚轴有缺陷，如缩短、变粗或残缺、深度破裂、中心撕裂、收缩、弯曲、形成环状、严重弯曲、形成螺旋状、纤细、玻璃状、由初生感染引起的糜烂。
子叶 其缺陷已扩散到无功能组织50%以上、如肿胀、卷曲或其他畸形、损伤、分离、残缺、褪色、有坏死斑点、玻璃状、由初生感染引起的糜烂。
顶端或其周围组织 有缺陷。
（8）西瓜种子发芽方法 西瓜种子发芽技术规定（BP,S，20～30℃,25℃，5d，14d，要求低湿）。
采用纸巾卷发芽，先将纸巾卷浸湿，拧干，再用干纸吸去多余水分，达到低湿的要求，取两层平铺在工作台上，编号，摆放平整，数取50粒种子置床，盖上一层湿发芽纸，左边折2cm，卷成松的纸卷，垂直竖在透明塑料盒中，套上透明塑料袋，放在25℃光下发芽，第五天打开纸卷计数正常发芽种子数，拿去、记录，未发芽种子卷回继续发芽，第十天再检查一次，到第十四天打开纸卷，计数正常、不正常和死种子数。
①正常幼苗（幼苗全部主要构造均应正常）：
根系 初生根完整或仅有轻微缺陷，如褪色、有坏死斑点、破裂不深且已愈合、如初生根有缺陷、但次生根发育正常、且有足够的数目。
幼芽 下胚轴完整或仅有轻微缺陷，如褪色、有坏死斑点、破裂不深且已愈合、稍有弯曲。
子叶 完整或仅有轻微缺陷，如有功能组织大于50%，有三片子叶。 顶芽 完整。
②不正常幼苗（有一个或几个主要构造不正常、或正常发育受阻，整个幼苗有如下缺陷：畸形、破碎、先长子叶后长根、两株连生在一起、黄化或白化、纤细、玻璃状、由初生感染引起的糜烂）：
根系 初生根有缺陷和无功能次生根或残缺，如发育不良、停滞、残缺、破裂、从顶端破裂、收缩、卷曲、纤细、卷缩在种皮内、负向生长、玻璃状、由初生感染引起的糜烂。
幼芽 下胚轴有缺陷，如缩短、变粗或残缺、深度开裂、中心撕裂、收缩、卷曲、形成环状、紧密卷曲或螺旋形、纤细、玻璃状、由初生感染引起的糜烂。
子叶 有缺陷，无功能组织已扩散到50%以上，如肿胀、卷曲、畸形、分脱、残缺、褪色、有坏死组织、玻璃状、由初生感染引起的糜烂。
顶芽或其周围已损伤或糜烂。 六、实验结果
根据测定结果填写实验报告。
表1 种子发芽试验记载表 试验编号 作物名称 发芽前处理 记载日 合计 试验结果 正 硬 新 不 死 合计 记载天 发芽床 品种名称 发芽温度 重复 置床日期 年 月 日 每重复置床种子数 持续时间 期 数 正 硬 正 硬 新 不 死 新 不 死 正 硬 新 不 死 正 硬 新 不 死 正常幼苗 % 硬实种子 % 新鲜未发芽 % 不正常幼苗 % 死种子 % 附加说明： 七、思考题
1.试述小麦种子的发芽技术方法。 2.试述玉米种子的发芽技术方法。 3.试述大豆种子的发芽试验方法。 4.试述水稻种子的发芽试验方法。
实验四 种子生活力的测定（4学时）
一、实验目的
种子生活力是指种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力。可以通过发芽试验方法了解种子有无生活力，为正确评定种子质量提供依据。本实验的目的是让学生掌握化学快速测定种子生活力的原理、方法和鉴定标准。 二、实验要求
掌握四唑染色测定种子生活力所需试剂和测定原理，掌握主要种子种类四唑染色测定种子生活力的方法和判别有无生活力的鉴定标准。了解MTB法和红墨水法测定种子生活力的原理和鉴定标准。 三、实验原理
四唑染色测定的原理：种子活细胞里发生的还原反应通过一种指示剂的还原作用而显现出来。所用的指示剂是一种可被种子组织吸收的四唑盐类无色溶液，它在种子组织里面参与活细胞的还原过程，从脱氢酶接受氢离子，使氯化（或溴化）三苯基四氯唑经过氢化作用，在活细胞里产生红色、稳定、不扩散的TTCH。这样就可以根据四唑染成的颜色和部位，区分种子红色的有活力部位和无色的死亡部位。除了完全染色的有活力种子和完全不染色的无活力种子外，还可能出现一些部分染色的异常颜色或不染色的坏死组织。种子有无活力主要取决于胚和（或）胚乳（或配子体）坏死组织的部位和面积大小，而不一定在于颜色的深浅。根据颜色的差异主要是将健全的、衰弱的和死亡的组织鉴别出来，并确定其染色部位。
BTB法的测定原理：有活力种子的活细胞有呼吸作用，吸收空气中的氧气，放出二氧化碳，二氧化碳溶于水变成碳酸，碳酸解离成HHCO,使得种胚周围酸度增加。用BTB做指示剂来测定酸度的改变。BTB的变色范围为PH值6.0～7.6，酸性呈黄色，碱性呈蓝色，中间经过绿色。因此，活种子周围是黄色晕圈，而无生命力的种子则无此反应。
红墨水法的测定原理：活细胞的原生质膜具有选择吸收能力，而死亡的种胚细胞原生质膜丧失这种能力，于是染料就能进入死细胞而染色。 四、实验材料和仪器试剂
小麦、玉米、大豆、番茄、黄瓜等不同作物的种子、天平、玻璃培养皿、发芽纸或滤纸、烧杯、尺子、毛巾、冰箱、智能人工气候箱、培养箱、定量加样器、镊子、放大镜、解剖针、刀片、吸水纸、2，3，5-氯化三苯基四氯唑、磷酸缓冲液、乳酸苯酚透明剂、过氧化氢、硫酸钾铝、琼脂凝胶、氨水、红墨水、酸度计、低温低湿储藏箱等。 五、实验方法和步骤 （一）四唑染色测定方法
1.小麦、玉米种子四唑染色测定 取种子样品200粒，放入水中30℃条件下3～4h，或纸间12h，沿胚纵切，浸入0.1%四唑溶液中。35℃条件下0.5～1h。凡是胚的主要构造染成正常鲜红色，或盾片上下任一端三分之一不染色的（小麦胚根大部不染色，但不定根原基染色），为有活力种子。如盾片中央不染色，表明已受热损伤，作为无生活力种子。
2.大豆种子四唑染色测定 取大豆种子样品200粒，放在湿毛巾间预湿12h，一般需剥去种皮，然后浸入1%四唑溶液，35℃条件下2～3h，凡是整个种子染色正常明亮鲜红，或仅胚根
＋
3－
尖端二分之一不染色，或子叶顶端（离胚芽端）二分之一不染色的即为有活力种子。 3.番茄种子四唑染色测定 取样200粒种子，放湿纸间30℃条件下预湿12h，然后在种子中心刺破种皮和胚乳，浸入0.2%四唑溶液，在35℃条件下染色反应0.5～1.5h。凡是胚和胚乳全部染色的，为有活力种子。
4.黄瓜和西瓜种子四唑染色测定 取种子样品200粒，浸入水中，30℃条件下6～8h，可纵切一半，或剥去种皮（因西瓜种子表面滑溜可用软布揩擦或用5%硫酸钾铝硬化液处理，然后进行上述样品准备）。浸入1%四唑溶液35℃条件下2～3h。凡是整个胚染成鲜红色，或仅胚根尖端二分之一不染色，或仅子叶顶端二分之一不染色的为有活力种子。
5.棉花种子四唑染色测定 取种子样品200粒，放纸间预湿，30℃条件下12h，纵切一半种子，或剥去种皮，浸入05.%的四唑溶液，染色反应2～3h。凡是整个种子染成明亮红色，或仅胚根尖端三分之一不染色，或子叶表面有小范围坏死，或子叶顶端三分之一不染色，为有活力种子。
6.洋葱种子四唑染色测定 取种子样品200粒，放在湿纸间30℃条件下预湿12h，沿扁平面切去种子上面，露出胚体，放入0.2%四唑溶液0.5～1.5h。凡是种胚和胚乳全部染成鲜红色，或仅少量不与胚相连的胚乳不染色的，为有活力种子。
7.黑麦草种子四唑染色测定 取200粒种子，先用0.3%过氧化氢溶液浸种3～4h，或清水浸种6～18h，靠近胚横切去上大半粒种子，将带有胚一端种子浸入0.1%四唑溶液，30℃条件下6～24h，倒去四唑溶液，并吸去残液，滴入乳酸苯酚液，35℃条件下30分钟。凡是胚全部染成红色，或仅胚根尖端三分之二不染色的，为有活力种子。 （二）BTB法测定方法
配制1%的琼脂凝胶，内含0.1%BTB，用稀氨水溶液数滴调溶液颜色为蓝绿色或蓝色。趁热倒入数个培养皿中，使其摊成均匀的薄层，冷却凝固之前取吸胀的种子100粒，两次重复，整齐的将胚向下于凝胶中，或者平放种子，间距至少1cm。将培养皿加盖置于30～35℃下培养2～4h后，在蓝色背景下观察，如果种胚周围出现较深黄色晕圈是活种子，否则是死种子。 （三）红墨水法测定方法
取吸胀的种子100粒，两次重复，沿种胚中线切为两半，将一半置于培养皿中，加入5%的红墨水（以淹没种子为宜），染色5～10分钟。倒去红墨水液，用水冲洗多次至冲洗液无色为止。凡是种胚不着色的为有活力种子。 六、实验结果及数据处理
计算各种活力测定结果，评定不同种子批的生活力差异， 七、思考题
1. 分析不同生活力测定方法的生产意义。 2. 比较不同测定方法结果的差异，并分析原因。 3. 分析染色不正常无生活力种子的类型及其原因。