粪便，肛拭子 需氧培养 直接涂片检查 G染色动力 增菌培养 及制动试验 初步报告 碱性蛋白胨水 GN肉汤/亚硒酸盐肉汤 TCBS/4号琼脂等 菌落、生化反应 血清学分群、分 型 报告结果 KIA、 MIU上生化反应： 厌氧、微需氧及特殊培养 直接分离 SS、MAC/EMB 菌落形态 生化反应 血清凝集 KIA MIU 斜面 底层 产气 H2S 动力 吲哚 脲酶 福氏/鲍氏志贺菌 K A －/＋ － － ＋/－ － 伤寒沙门菌 K A － ＋/－ ＋ － －
志贺菌属的分型鉴定：
凡生化反应符合志贺菌属者均需作血清学鉴定。取一环志贺菌四种多价血清于载玻片一端，再取少许待测菌与之混合，同时在玻片另一端取待测菌与生理盐水混合对照。
结果：对照呈均匀混浊，待检菌与志贺菌四种多价血清混合后，数分钟内出现肉眼可见的颗粒状凝集物即为阳性。继之用A、B、C、D群最常见的单价血清凝集定种。
注意事项：
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1．肠道内存在大量的正常菌群，除非为了正常菌群的调查和鉴定，一般分离可疑致病菌应使用选择性平板。 2．最好采集急性期，抗生素使用前的粪便标本，进行床边接种。
3．除怀疑霍乱弧菌、结核分枝杆菌和菌群失调引起的腹泻外，粪便标本一般不做涂片检查。在以糖类发酵为鉴别依据的培养基上，发酵型菌落进行氧化酶试验时会出现假阴性。在选择性平板上挑取菌落时，应使用接种针从菌落中心挑取，而不应使用接种环刮取菌落。
4．沙门菌属容易丢失鞭毛抗原，此时要通过诱导使鞭毛恢复，才能鉴定。
实验六 变形杆菌、弧菌、绿脓、白喉、结核Ⅰ 1．示教：
（1）普通变形杆菌、铜绿假单胞菌在BAP、SS、MAC、肉汤中生长现象 （2）弧菌在TCBS、碱性蛋白水生长现象 （3）普通变形杆菌迁徙生长现象（点种）
（4）白喉棒状杆菌在吕氏血清斜面、亚碲酸钾BAP、BAP上菌落 （5）结核分枝杆菌形态示教片和在罗氏培养基上菌落
2．操作：
（1）普通变形杆菌、铜绿假单胞菌接种BAP、SS、MAC、KIA、MIU （2）弧菌接种TCBS
（3）白喉棒状杆菌接种亚碲酸钾BAP、BAP （4）痰标本涂片抗酸染色镜检 Ⅱ 1．示教：
（1）普通变形杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌在KIA、MIU生化反应 （2）弧菌形态示教片、白喉异染颗粒示教片 2．操作： （1）观察试验结果
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（2）白喉棒状杆菌涂片G染色、Albert染色 （3）白喉触酶试验、普变、绿脓氧化酶试验
三、讲解：
前面几周学习了肠道中主要的致病菌（沙门和志贺），本周来学习肠道中几种其他的肠道致病菌（变形杆菌、假单胞菌属和弧菌属），它们多属于肠道内正常菌群或广泛存在于自然界，在一定条件下可引起人类各种感染。
变形杆菌是一群动力活泼、格兰阴性的细菌。广泛存在于土壤、污水和垃圾中。共有8个菌种。其中奇异变形杆菌和普通变形杆菌引起人类原发和继发感染，只有离开肠道后才能引起，是仅次于大肠杆菌的泌尿道感染的主要病原菌，且与肾结石和膀胱结石有关。
假单胞菌属是一群需氧、有鞭毛、无芽孢的格兰阴性杆菌。其中铜绿假单胞菌广泛分布于自然界及人和动物机体皮肤及肠道中，是常见的条件致病菌，由于在生长过程中产生绿色水溶性色素，感染后的浓汁或敷料上出现绿色，故名。
1）普通变形杆菌、铜绿假单胞菌在BAP、SS、MAC、肉汤中生长现象： BAP MAC S.S 肉汤 普变 迁徙现象（同心圆） 乳糖不发酵无色乳糖不发酵无色均匀浑浊表面菌透明 半透明H2S（+）膜管底沉淀 黑色沉淀点 绿脓 中等大小扁平湿润金属光乳糖不发酵无光乳糖不发酵无色表面形成菌膜深泽特殊气味灰绿色或蓝绿泽半透明延迟培半透明H2S（—） 部微浑浊上层蓝色菌落菌落周围有beta溶养可形成棕绿色绿色 血 菌落 弧菌在TCBS、碱性蛋白水生长现象： TCBS（硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖）成分：
基本成分（酵母浸液、蛋白胨和氯化钠） 硫代硫酸钠、枸橼酸铁：H2S
胆盐、胆酸钠、枸橼酸钠：抑菌剂 蔗糖
指示剂：溴麝香草酚蓝：酸性为黄色，碱性为蓝色。 碱性蛋白胨水成分：
蛋白胨、氯化钠、水：基本营养成分，NaOH调节PH8.4~8.5
TCBS：发酵蔗糖产酸，PH下降，酸碱指示剂变色，菌落变为黄色。
碱性蛋白胨水：PH8.5碱性蛋白胨可抑制杂菌生长，弧菌不被抑制，液体表面大量繁殖形成菌膜。
形态观察：
G-，菌体稍弯曲呈弧形或逗点状，无荚膜和芽胞，排列似“鱼群” 样。 *在观察结果时要注意以下几种情况：
（1）自患者新分离出的霍乱弧菌，菌体短小，形态典型，可呈逗点状；
（2）直接由米泔水样粪便作涂片时，常见呈弧形互相衔接，平行排列，状如鱼群； （3）在人工培养基上保持稍久后，则失去典型弧形，成为杆状，与其它肠道杆菌不易区别； （4）在陈旧培养物中，本菌可出现衰退变化，呈颗粒状或不规则肿大，着色不良。
菌落观察：
在碱性蛋白胨水中呈均匀混浊，有时在液体表面生成菲薄菌膜；在碱性琼脂平板上可形成较大、圆而扁平或稍凸起、无色透明或半透明似水滴及淡蓝灰色的菌落，菌落表面光滑或有微细颗粒。因分解蔗糖产酸，在TCBS平板菌落及周围呈黄色。因能还原亚碲酸钾，在4号琼脂平板菌落中心呈褐色。 （3）普通变形杆菌迁徙生长现象（点种）
变形杆菌属（普变和奇变）大多数菌株可在BAP和普通平板上（点种）形成蔓延扩散性生长，形成以菌接
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种部位为中心的厚薄交替、同心圆形的层层波纹状菌苔，布满整个平板表面，而不形成单个菌落，称为迁徙现象。为该菌特征，可用于细菌鉴定。迁徙现象可被石碳酸、胆盐等抑制而形成单个菌落。 （4）白喉棒状杆菌在吕氏血清斜面、亚碲酸钾BAP、BAP上菌落
白喉杆菌为需氧或兼性厌氧菌，最适温度34～36℃，普通琼脂平板上能生长但生长不良，形态不典型。在含血液或血清的培养基上生长迅速，形态典型，异染颗粒明显。常用培养基为BAP，吕氏血清斜面，亚碲酸钾血平板。
BAP：35℃24h，菌落直径1～2mm、灰白色、不透明的光滑型、轻型有狭窄β溶血环。
吕氏血清斜面：生长最快、形态最典型，6h即生长，10～12h长出灰白色、湿润、有光泽的光滑型菌苔或菌落，菌体形态典型、异染颗粒明显，连续传代可保持形态和产毒性能不变。
亚碲酸钾BAP：（选择鉴别培养基）主要用于初次分离培养，含0.03%～0.04%亚碲酸钾，可抑制其他细菌生长，本菌可选择性生长。在生长过程中亚碲酸盐离子透过细胞膜进入细胞质，还原成元素碲而沉淀，形成黑色菌落，是鉴定依据。35℃18～24h，不同菌型还原能力不同，呈现黑色或灰黑色菌落。 （5）结核分枝杆菌形态示教片和在罗氏培养基上菌落
霍乱弧菌生化反应：
KIA MIU 其他 斜面 底层 产气 H2S 动力 吲哚 脲酶 氧化酶 粘丝试验 K A – – + + – + +
鉴定：
观察菌落特征并作动力检查、然后取可疑菌落以O1群霍乱多价免疫血清做玻片凝集试验。
玻片凝集试验（血清学试验）：
分别取1滴霍乱弧菌多价免疫血清和生理盐水滴加在玻片的左右两个分区内，生理盐水作对照。用接种环挑取霍乱弧菌菌落少许，加于右侧的生理盐水中混匀，再用灭菌接种环取待测霍乱多价免疫血清，混匀，2～3min后，观察是否出现凝集现象。
变形杆菌：
G-杆菌，两端钝圆、有明显多形性，可为球形或丝状。有周身鞭毛、运动活泼，无芽胞、无荚膜。 普通变形杆菌和奇异变形杆菌的大多数菌株在普通琼脂平板和血平板可蔓延成波纹状薄膜布满整个培养基表面，称为迁徙生长现象，是本属细菌的特征。
肠道选择鉴别培养基——圆形、扁平、无色半透明、乳糖不发酵的菌落；产H2S菌株在SS上菌落中心呈黑色。
生化反应特征是：H2S（+）、苯丙氨酸脱氨酶（+）、脲酶（+++）
铜绿假单胞菌：
G-细长且长短不一的杆菌，可呈球杆状或长丝状，成双或短链状排列。一端有单鞭毛，运动活泼。 可产生多种色素，如绿脓菌荧光素、绿脓素、玉红脓素。
BAP：大而扁平、湿润、有金属光泽、蓝绿色菌落，有透明溶血环，有生姜味。 MAC：微小、半透明菌落，48h菌落中心常呈棕绿色。 SS：类似沙门菌的菌落，培养稍久菌落可呈棕绿色。
肉汤：18～24h液面可形成菌膜，细菌在深层发育不良、呈微混浊或透明状，菌液上层为蓝绿色。
氧化酶试验： *原理：
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某些细菌（如脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌等）具有氧化酶，能将盐酸二甲基对苯二胺或盐酸四甲基对苯二胺氧化成紫红色的醌类化合物。
*方法：
用滤纸条沾取被检菌落，用毛细管吸取氧化酶试剂，滴加于滤纸条菌落上（或直接将试剂滴加于培养皿菌落上）
*结果：
阳性者立刻出现红色，继而逐渐加深（如加的试剂是盐酸四甲基对苯二胺，阳性呈蓝色）。阴性不变色。脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌为阳性，肠杆菌科细菌、普变、弧菌为阴性。
触酶试验：白喉杆菌触酶试验阳性。方法同以前的方法。
普通变形杆菌、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌在KIA、MIU生化反应： 菌名 KIA 乳糖 MIU 葡萄产H2S 动吲脲糖 气 力 哚 酶 A A － + + + + － － + + + 氧化酶 普通变形杆菌 K 奇异变形杆菌 K 铜绿假单胞菌 － + + － － + － － +/－ + 葡萄糖O/F F F O 痰标本涂片抗酸染色镜检： 1．制片： 取高压灭菌后病人痰标本涂片，干燥，固定。
2．抗酸染色：
初染——用木夹夹住玻片，在玻片上滴加石炭酸复红染液（盖住菌膜），用火焰徐徐加温，至染液出现白色蒸汽（不要煮沸），保持染液温热5min（随时添加染色，以防干涸），待冷后以水流淌洗玻片上的染液。 脱色——滴加3%盐酸酒精于菌膜上，轻轻摇动，脱色30sec左右，水洗。 复染——滴加碱性美兰染液，染色1min，水洗，干燥后，油镜观察。
3、结果：
结核杆菌菌体染成红色，背景及非抗酸菌呈蓝色。在痰液标本内结核杆菌多单个存在，有时呈分枝状如V、Y、人字形排列，菌多时可聚集成束状或团状；
白喉棒状杆菌形态：
G+细长微弯的杆菌，一端或两端膨大呈棒状，常排列呈V、L、X等文字形。用美蓝短时间染色菌体着色不均匀，出现有深染的颗粒。用Neisser、Albert等法染色时菌体一端或两端有2～5个浓染颗粒，这些颗粒与菌体着染颜色不同，称为异染颗粒，颗粒的主要成分是由胞质内核糖核酸和多偏磷酸盐的堆集而成，是本菌形态上的鉴别特征。但当细菌衰老时异染颗粒被消耗而不明显，且细胞壁变薄易被脱色，常造成革兰染色不定，有时在革兰阴性的菌体中见有阳性颗粒或节段
阿尔培（Albert）染色法：
甲液（甲苯胺蓝、孔雀绿、冰醋酸、95%乙醇）5分钟后水洗，乙液（碘、碘化钾）1分钟后水洗，干后镜检，菌体呈草绿色，异染颗粒呈紫褐色。
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